[发明专利]Ⅱ型副流感病毒荧光定量PCR试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种II型副流感病毒检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RNA提取液；RT-PCR反应液；混合酶；阳性标准模板；阳性对照和阴性对照。

2.如权利要求1所述的II型副流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液含PCR Buffer溶液；0.1～10μM浓度的引物P1、P2；0.1～10μM浓度的荧光探针FP；0.1～1mM的dNTPs溶液和1～10mM的MgCl₂。

3.如权利要求2所述的II型副流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液中引物(P1、P2)和探针(FP)为II型副流感病毒HN基因片段，其中引物P1序列为：5’-CAATGGGACGCCTAAATATGGA-3’，引物P2序列为：5’-GAGGCAATCTCCAAGCATTACA-3’，荧光探针FP序列为：5’-AGACCCATTGGTGTTACACTCACAA-3’；

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

4.如权利要求3所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针标记的发光基团为FAM、HEX、JOE、TET、Cy3、Cy5、ROX、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、FITC或Acridine orange中的任意一种；荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或DABSYL中的任意一种。

5.如权利要求1所述的II型副流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的混合酶由1～10U的逆转录酶SuperscriptIII和1～10U的Taq DNA聚合酶配制而成。

6.如权利要求1所述的II型副流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性性标准模板为含有II型副流感病毒HN基因片段SEQ ID NO.1与PGEM-T Easy载体构成的PGEMT151重组质粒SEQ ID NO.2。

7.如权利要求1所述的II型副流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的II型副流感病毒阳性样本；阴性对照为无模板荧光定量反应液。

8.如权利要求1所述的II型副流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的RNA提取液为提取效率＞80％、RNA完整性好、稳定性好且操作简便的核酸提取液。

9.一种II型副流感病毒检测方法，其特征在于，采用II型副流感病毒检测试剂盒，按以下步骤进行：

(a)采RNA提取液从待测标本中提取RNA；

(b)将标准阳性模板进行10倍梯度稀释；

(c)分别取第(a)步中的RNA和第(b)步中的阳性标准模板，加入到含有混合酶的RT-PCR反应体系中，与标准阴性质控品一起用荧光定量PCR检测仪进行RT-PCR检测；

(d)通过比较待测样本和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量，在荧光定量PCR仪自带软件生成的标准曲线上找出待测样品对应的拷贝数浓度。

10.如权利要求9所述的II型副流感病毒检测方法，其特征在于，所述的待测样本为痰液、咽拭子。