[发明专利]附红细胞体裸鼠感染模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种预防医学领域的疾病动物模型的构建方法，具体涉及一种附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法。

背景技术

附红细胞体(Eperythrozoon)病是由EH引起多种哺乳动物感染的一种常见传染病，对畜牧业生产造成巨大危害，同时近年来越来越多的人感染EH的病例报告以及流行病学调查证实EH感染严重威胁人类健康，并将其定义为一种新发人兽共患病，构成潜在的公共卫生问题。该病原主要寄生于人和动物的红细胞表面、血浆及骨髓中，以贫血、黄疸、发热等为主要临床症状。并有隐性感染、慢性迁延、条件致病、急性发病时致死率高的特征。因此，建立一个稳定的附红细胞体病感染特点的动物模型对于研究该病的致病机理，免疫学，流行病学都尤为重要。

经过对现有方法的文献检索发现，附红细胞体动物模型的研究主要是通过以附红细胞体的全血感染切脾或注射地塞米松的实验动物来获得。如：刘冰等在2007年《中国兽医科学》37期12-15页中，描述了一种附红细胞体裸鼠感染模型的建立方法。利用摘除脾或注射地塞米松的昆明小白鼠，以腹腔注射方式人工感染附红细胞体全血建立了附红细胞体感染模型，这种方法虽然可以建立附红细胞体的动物模型，但是，此模型存在两个缺陷：(1)采用全血作为感染源会将白细胞等其它血液组分一起注射至实验动物体内，而这些血液组分对实验动物来讲是一大类免疫原，将会严重影响试验结果。(2)采用免疫抑制剂或切脾等状态下的建立动物模型，步骤繁琐且容易引起外伤感染。因此，如果一个动物模型可以稳定地复制出附红细胞体感染，并且能克服这两个缺陷，对附红细胞体的深入研究将具有独特的价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题，本发明提供一种附红细胞体的裸鼠感染模型的构建方法。本发明采用分离纯化的附红细胞体作为感染源通过静脉注射SPF裸鼠得到。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括以下步骤：

①从感染附红细胞体病的抗凝血中分离纯化出附红细胞体；

所述的分离纯化的附红细胞体是指从附红细胞体感染血液中通过热处理(50度处理10分钟)，将附红细胞体与红细胞解离，梯度离心分离附红细胞体重悬于无菌的生理盐水中，此悬液为分离纯化的附红细胞体悬液。

②裸鼠的饲养，饲养于熏蒸消毒的隔离室内；

③对裸鼠静脉接种；

所述的对裸鼠静脉接种，是指对裸鼠接种纯化的附红细胞体悬液，具体为：对7周龄SPF裸鼠尾静脉注射100ul纯化的附红细胞体悬液，其中附红细胞体数目大于等于10⁷个。

④动物模型的检测，验证附红细胞体裸鼠感染模型显示出附红细胞体感染红细胞的结构。

所述的检测，是包括鲜血压片镜检，PCR检测和透射电镜镜检三步法的综合检测。

其中PCR检测引物是根据附红细胞体16S rRNA序列设计，上游为5′-CACGCCGTAACGATGGGTAT-3′，下游为：5′-CAGCCCAAGGCATAAGGGG-3′.可扩增出长度为396bp的片段。

根据上述步骤，通过三种检测方法验证，证实本发明中附红细胞体SPF裸鼠感染模型构建成功。

所述的感染，以分离纯化的附红细胞体作为感染源。由于感染源单一，使模型的建立更为标准和稳定。所述的接种，是指：静脉注射，对实验动物无需进行切脾手术或者注射地赛米松等也能获得较高的感染率。所述的裸鼠为一种免疫缺陷型无胸腺裸鼠，有利于病原在动物体内复制。

本发明完全弥补了目前附红细胞体动物模型构建的缺陷，是一种理想的动物模型。本发明的意义在于该模型可以用于附红细胞体病的致病机理，免疫学，流行病学等方面的提供研究依据和实验手段。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

SPF裸鼠，即无特定病原(Specific pathogen free animal，SPF)裸鼠的简称。为实验用鼠的一个国际通用标准级别，适用于大部分实验研究。

实施例1附红细胞体SPF裸鼠感染模型的构建

(1)分离纯化附红细胞体