[发明专利]一种检测甲型H1N1流感病毒RNA的靶序列及试剂盒

权利要求书

1.本发明提供一种用于检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的靶序列与试剂盒，其特征在于，采用基于该病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因设计的两对引物探针，在单个反应管中经一步法荧光RT-PCR同时检测甲型H1N1流感病毒(2009)两个靶序列RNA；试剂盒组分包括PCR缓冲液、RT/Taq混合酶、阴性对照及阳性对照。

2.如权利要求1所述，其特征在于，用于检测甲型H1N1流感病毒(2009)两个靶序列来源于该病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，分别具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中连续的70～300个核苷酸。

3.如权利要求1所述，其特征在于，所用的试剂盒含有两对特异性扩增甲型H1N1流感病毒(2009)的引物及两条荧光探针，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。

4.如权利要求3所述的试剂盒，一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.1中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1中所示的序列互补；另一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.2中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.2中所示的序列互补；两条荧光探针序列分别与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的序列相同或互补。

5.如权利要求3所述的试剂盒，所述一对引物序列可以选自SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；另一对引物序列可以选自SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；所述两条探针序列可以选自SEQ ID No.5和SEQ ID No.8的序列，其中一条探针5’端标记FAM荧光基团，另一条探针5’端标记HEX或JOE、VIC荧光基团，两条探针3’端均标记淬灭基团TAMRA或BHQ。引物探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

6.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：Tris-HCl(pH8.3)10mM，KCl 50mM，MgCl₂1.5～5mM，引物各0.2～0.5μM，两条探针各0.1～0.5μM、M-MLVRT酶和Taq DNA聚合酶各1～5U。

7.如权利要求1所述建立的试剂盒，在甲型H1N1流感病毒(2009)快速鉴定中的应用，包括以下步骤：

(1)样品处理提取模板RNA，样本包括鼻咽拭子、组织或培养物。

(2)模板RNA扩增检测，以荧光PCR仪上FAM和HEX通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中甲型H1N1流感RNA的存在。