[发明专利]一种检测甲型H1N1流感病毒RNA的靶序列及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于一种检测甲型H1N1流感病毒RNA的靶序列及试剂盒。

背景技术

甲型流感病毒(Influenza A virus)是正粘病毒科的线状单股负链RNA病毒，根据病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分成许多亚型，目前已发现的血凝素有16个亚型(H1～16)、神经氨酸酶有9个亚型(N1～9)。甲型H1N1流感病毒作为其中的一个病毒亚型，病毒颗粒呈多形态，一般为球形，直径为80～120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，即纤突和刺突，分别是柱状的血凝素(HA)、蘑菇状的神经氨酸酶(NA)和膜上的M2基质蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径10nm，两端具有环状结构，存在于病毒的囊膜内，由大小不等的8个独立片段组成，基因组大小约为1316kb。

甲型流感病毒基因之间重排、重组现象非常普遍和广泛，重组变异的病毒株常会造成不同程度的季节性流感流行和流感大流行。甲型H1N1流感病毒(2009)作为2009年在全球引起爆发和流行的新型重组流感病毒，经研究发现它是由4种病毒重组变异形成的：1种禽流感病毒、1种普通流感病毒和2种在猪之间广泛传播的猪流感病毒。人感染了甲型H1N1流感病毒(2009)后的症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉咙痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻和呕吐，重者会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。

一般流感病毒诊断常用的方法包括血清学诊断法、病毒分离培养法和特异性抗体检测法等。和这些方法比较，荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术具有准确灵敏、简便快速的优点，因此目前世界卫生组织和国家卫生部均推荐采用荧光RT-PCR技术检测甲型H1N1流感病毒(2009)并公布了引物探针序列，由于病毒的高度变异性、以及该序列在设计之初可供参考的病毒株基因公布序列较少，推荐使用的引物探针存在序列和现有公布的多数病毒株基因序列错配的问题，从而导致检测荧光值低、灵敏度不足甚至漏检。为了准确鉴定甲型H1N1流感病毒(2009)，有必要寻找另外的甲型H1N1流感病毒(2009)特异性核苷酸检测序列。

发明内容

本发明提供一种用于检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的靶序列与试剂盒，其特征在于，采用基于甲型H1N1流感病毒(2009)HA和NA基因靶序列设计的特异性引物探针，在单个反应管中通过一步法荧光RT-PCR检测甲型H1N1病毒RNA。本发明克服了世界卫生组织推荐使用的引物探针序列和现有公布病毒株基因靶序列错配的不足，所筛选的检测靶序列对2009年爆发的甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列具有更高的特异性，从而提高了检测的灵敏度和准确性，试剂盒适用于疾控和临床中甲型H1N1流感病毒(2009)的快速鉴定。

在本发明的第一方面，提供了一种检测甲型H1N1流感病毒(2009)的靶序列，它包括来源于该病毒HA和NA基因特定区域的两条序列，具有SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2中连续的70～300个核苷酸。

在本发明的第二方面，提供了一种检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的试剂盒，它含有两对特异性扩增甲型H1N1流感病毒(2009)靶序列的引物及相应的两条荧光探针，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.1所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1所示的序列互补；另一对引物序列中一条序列与SEQ IDNo.2所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.2所示的序列互补；两条荧光探针序列分别与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列相同或互补，其中一条探针5’端标记FAM(6-羧基荧光素)荧光基团，另一条探针5’端标记HEX(六氯-6-羧基荧光素)荧光基团，两条探针3’端均标记淬灭基团如TAMRA(6-羧基-四甲基罗丹明)或BHQ(Black Hole Quencher)。

在另一优选例中，所述两对引物序列可以选自SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；所述两条探针序列可以选自SEQ ID No.5和SEQ ID No.8的序列。引物探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

在另一优选例中，含有引物探针的试剂盒还包括PCR缓冲液、逆转录酶和Taq DNA聚合酶混合酶(RT/Taq混合酶)、阴性对照及阳性对照。