[发明专利]荧光素酶活性片段及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学和细胞生物学研究领域，具体涉及Gaussia荧光素酶活性核心片段GLuc 148的改造和应用。

背景技术

荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于其独特的发光特点和检测简便、灵敏、快速，荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因(reporter)；其在发光免疫分析、活体成像、活细胞共振能量转移(BRET)及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。

目前研究最多且常用的荧光素酶主要是：细菌荧光素酶(Bacterial Luciferase，简称BLuc)、萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，FLuc)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，RLuc)。相比而言，这些荧光素酶分子量相对较大，酶蛋白在溶液中的稳定性较差，有的在使用时需要共激活因子如ATP、Mg²⁺离子或Ca²⁺离子等，这在很大程度上限制了它们的应用范围。

Gaussia荧光素酶(Gaussia Luciferase，简称GLuc)是从海洋桡脚类动物中分离出的一种新型荧光素酶，目前关于它的研究和报道较少。GLuc不需要ATP来催化底物腔肠素(coelenterazine，CTZ)的氧化反应，且与其它发光报告基因相比还有许多如下的独特优势：

(1)GLuc的荧光信号比RLuc和FLuc高约1000倍，这使其成为更理想的转录报告因子；

(2)Gluc表达时分泌进细胞培养液中，测定不需要裂解细胞；

(3)在哺乳动物细胞中表达相对更稳定，为检测提供了便利；

(4)GLuc只有185个氨基酸，是所有已知荧光素酶中分子量最小的一种，便于进行性质改造和优化，未来可能成为最有发展前景的一种工具酶。

虽然，GLuc具有上述优点，但本领域仍然需要开发出分子量更小、可在真核细胞中非分泌型表达并产生强荧光信号的发光报告基因。

发明内容

本发明的目的之一正是提供一种经改造的荧光素酶，其具有发光活性高、不需要辅因子、生化性质稳定、分子量更小、在真核细胞中非分泌型表达，更适合作为报告因子和荧光能量供体，应用于细胞和活体成像、高通量筛选、微生物检测等技术领域。

具体而言，在本发明的第一方面，提供了一种荧光素酶活性片段，所述活性片段的序列是Gaussia荧光素酶缺失N端37个氨基酸残基所形成的序列，并且所述活性片段具有与野生型Gaussia荧光素酶一致的荧光素酶活性。

在本发明的一个实施方式中，所述活性片段适于在原核或真核细胞内表达。

在本发明的另一个实施方式中，所述活性片段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在一个优选例中，所述荧光素酶活性片段的分子量为16kDa。

在另一个优选例中，所述荧光素酶活性片段为非分泌型表达。

在本发明的第二方面中，提供了本发明荧光素酶活性片段的编码序列。

在本发明的一个实施方式中，所述编码序列选自：

(i)如SEQ ID NO：1所示的序列；和

(ii)在严格条件下能与SEQ ID NO：1的序列杂交的分子。

在本发明的另一个实施方式中，所述编码序列经密码子偏爱优化。

在本发明的第三方面中，提供了本发明的荧光素酶活性片段或其编码序列在作为报告因子、荧光能量供体中的用途。

在本发明的第四方面中，提供了本发明的荧光素酶活性片段或其编码序列在细胞或活体成像、药物的高通量筛选、微生物检测或蛋白质拓朴结构鉴定中的用途。

在本发明的第五方面中，提供了一种试剂盒，其包含：本发明的荧光素酶活性片段或其编码序列。

在一个优选例中，所述试剂盒还任选包含：用于测试的容器、缓冲液、底物、稀释剂和/或使用说明书。

在本发明的第六方面中，提供了一种制备荧光素酶活性片段的方法，所述方法包括步骤：使得Gaussia荧光素酶缺失N端37个氨基酸残基。

在一个优选例中，所述缺失是通过化学合成、或使用重组技术从原核或真核宿主中产生相关序列而完成的，优选所述宿主选自：细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞。

在本发明的另一实施方式中，提供了一种鉴定蛋白质拓朴结构的方法，所述方法包括：

将荧光素酶活性片段插入待确定其拓朴结构的蛋白质的不同位点，从而获得融合蛋白；以及

检测融合蛋白所产生的荧光强度；