[发明专利]一种人转铁蛋白的表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种人转铁蛋白的表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

转铁蛋白(TF)是一种非血红素的铁结合糖蛋白，能使得铁离子与之紧密结合，并将其有选择地释放到特定部位与靶细胞上的特异受体结合以行使生理功能(Schanbacher FL，et al..J Dairy Sci.1993，76(12)：3812-3831)，同时它还参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节(Zakin MM，et al..Dev Neurosci.2002，24(2-3)：222-226)，最近还有报导称转铁蛋白是胚胎干细胞和神经干细胞生长非常重要的一种调节因子(Lu J，et al..Proc Natl Acad Sci USA.2006，103(15)：5688-5693；Kanemura Y，et al.Cell Transplant.2005，14(9)：673-682；Koivisto H，et al.ReprodBiomed Online.2004，9(3)：330-337)，它的开发利用具有重要的经济和社会效益。

TF主要在肝脏、脑及生殖器官中表达，在一些物种的乳腺中亦发现有TF的表达。对比各种物种的TF的表达水平发现，人TF表达水平较低，以在乳汁中的表达水平为例，人TF的表达水平不到50μg/mL，而兔TF的表达水平达到了2mg/mL。人、兔两个物种的TF在乳汁中的含量相差甚远，但它们的TF启动子却具有一定的同源性。

本申请的发明人克隆得到了226bp的兔转铁蛋白启动子(RP promoter)，并以pcDNA3.1(-)为骨架，在其多克隆位点处顺次插入RP和人转铁蛋白(hTF)小基因，得到表达载体δpcDNA3.1-RP-hTF，并转染大鼠肝脏细胞株BRL-3A分析hTF表达情况。结果表明，RP可以启动hTF的表达，但效率并不高，在表达载体δpcDNA3.1-RP-hTF转染的BRL-3A细胞的上清培养液中，hTF的表达水平仅为30ng/ml左右(潘树标，颜景斌，任兆瑞.人转铁蛋白重组载体的构建及其表达调控的研究，中国生物工程杂志，2008，28(6)：50-55)。因此，期待能构建进一步提高hTF表达的载体，以利于今后转基因动物生物反应器的研究和应用。

发明内容

本发明的第一个目的，在于提供一种人转铁蛋白的表达载体。

本发明的第二个目的，在于提供人转铁蛋白表达载体的构建方法。

本发明的第三个目的，在于提供人转铁蛋白表达载体的应用。

本发明的人转铁蛋白的表达载体，由人转铁蛋白小基因，兔转铁蛋白启动子，兔转铁蛋白增强子以及去除CMV启动子的pcDNA3.1(-)载体构成。

本发明的人转铁蛋白的表达载体，所述兔转铁蛋白启动子接在所述人转铁蛋白小基因的上游，所述兔转铁蛋白增强子接在所述兔转铁蛋白启动子的上游。所述人转铁蛋白小基因包含人转铁蛋白的cDNA和内含子1。所述人转铁蛋白小基因的序列如SEQ ID No.1所示。所述兔转铁蛋白启动子的序列如SEQ ID No.2所示。所述兔转铁蛋白增强子的序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的人转铁蛋白的表达载体，所述兔转铁蛋白增强子的数目为一个，构成的载体为δ3.1-EP-TFN；所述δ3.1-EP-TFN载体的序列如SEQ ID No.4所示。

本发明的人转铁蛋白的表达载体，所述兔转铁蛋白增强子的数目为两个，串联接在所述兔转铁蛋白启动子的上游，构成的载体为δ3.1-2EP-TFN；所述δ3.1-2EP-TFN载体的序列如SEQ ID No.5所示。

本发明的人转铁蛋白表达载体δ3.1-2EP-TFN的构建方法，包括以下步骤：

A、构建去除CMV启动子的载体pcDNA3.1；

B、扩增人转铁蛋白小基因，接入pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1-TFN载体；

C、扩增兔转铁蛋白启动子，接入pSL301载体，获得301-RTF载体；

D、扩增兔转铁蛋白增强子，接入pGEM-T载体，获得T-RTFE载体；

E、两个T-RTFE载体和一个301-RTF载体连接获得pSL301-2EP载体；

F、pSL301-2EP载体和δpcDNA3.1载体连接获得δ3.1-2EP载体；

G、δ3.1-2EP载体和pcDNA3.1-TFN载体连接获得δ3.1-2EP-TFN载体。

本发明的人转铁蛋白表达载体δ3.1-EP-TFN的构建方法，包括以下步骤：