[发明专利]沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测沙眼衣原体感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。

背景技术

沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，CT)为革兰阴性病原体，是一种严格的专性细胞内寄生的微生物。沙眼衣原体是常见的性传播疾病、非淋菌性尿道炎的主要病原体，它不仅会导致阴道、尿道的感染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆腔结构，导致盆腔炎、输卵管损伤直至不孕。由于沙眼衣原体感染后无特异性临床表现，因此实验室检查十分重要。

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。

荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方法涉及的是Taqman探针技术。其工作原理是：它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’→3’酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四氯-6-羧基荧光素)，JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)，HEX(六氯-6-甲基荧光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。

发明内容

为克服传统方法(如电泳法等)对CT检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低并且能够作定量检测的检测产品。技术方案如下：

一种沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性参考品、阳性参考品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR扩增引物、特异性荧光探针。

所述的阳性参考品和阳性工作标准品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下：

CTGTTTGCAAACTGTTCATCGCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGGTTTTAAAAAATGTTCGACTATTTTCTTGTTTAGAAGGTTGCGCTATAGCGACTATTCCTTGAGTCATCCTGTTTAGGAATCTTGTTAAGGAAATATAGCTTGCTGCTCGAACTTGTTTAGTACCTTCGGT    175bp。

所述的阳性参考品为存放浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁷拷贝/毫升的重组质粒。

所述阳性工作标准品分别为存放浓度为5.0×10⁴、5.0×10⁵、5.0×10⁶、5.0×10⁷拷贝/毫升的重组质粒。

所述的阴性参考品为CT阴性血清。

所述的PCR扩增引物序列如下：

扩增检测沙眼衣原体的正向引物    GCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGG  25bp；

扩增检测沙眼衣原体的反向引物    GAGCAGCAAGCTATATTTCCTTAACA 26bp。

所述的特异性荧光探针序列如下：

检测沙眼衣原体的探针    GCGACTATTCCTTGAGTCAT  20bp。

所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、BHQ0、BHQ1、BHQ2。

在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

①定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能实时监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；