[发明专利]一种筛选麦类作物耐赤霉病菌毒素的方法

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种技术领域，涉及以种子作为繁殖方式的麦类作物的抗赤霉病性状的改良方法。

背景技术

小麦是我国人民的主要食粮，大麦是制造啤酒的主要原料。麦类赤霉病不仅能导致产量严重下降，更严重的是，由于病原菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇等毒素积累于病麦粒，影响人类健康。由于目前尚缺乏有效的防治技术，加之化学防治造成环境污染，因而，培育抗性品种是防止麦类赤霉病最有效的方法。国内外多年来麦类抗赤霉病育种的实践表明，传统杂交育种技术选育高抗材料的效率低，并且需要大量杂交后代群体作依托。所以，研发一种有效的实验室抗赤霉病筛选方法，必将提高大、小麦抗赤霉病育种的效率。

国内外研究表明，赤霉病菌毒素作为小麦抗赤霉病性的筛选剂已得到肯定(陆维忠等，2001)，组织水平耐赤霉病毒素的能力与供体植株水平耐赤霉病能力存在明显的相关性(陆维忠，1998)。在不同耐赤霉病类型品种间杂交的F1小孢子群体中，无疑含有丰富的抗赤霉病重组配子体。通过适当的赤霉病菌毒素胁迫筛选，可以选择获得多抗源的抗病重组体(欧阳俊闻，1990；Fadel等，1993)。

相对于花药培养而言，游离小孢子培养提供了一个单倍体、单倍体细胞的实验操作系统，它对胁迫的反应更为敏感，胁迫存活的胚状体和再生植株所携抗性基因及所有基因经染色体自然或人工加倍后，全部一次性纯合，基因所控性状遗传稳定性极高。相对传统杂交育种的田间选择而言，本发明的选择效率更高，劳动强度大大降低，更易在短时间内获得抗病性提高的多抗源基因重组体。

本发明依据的科学原理是：植物细胞全能性理论，植株水平的性状与细胞水平的表达存在一致性的理论和植物对逆境的适应与抵抗有多种形式，其中通过交叉适应获得抗逆性是一种普遍而有效的方式的理论。

发明内容

本发明针对麦类作物现有种质材料中缺乏抗赤霉病品种的不足，提供一种新的麦类单倍体细胞水平耐赤霉病粗毒素再生株系的获得及离体筛选的方法，且筛选条件易于统一控制，不受外界自然条件的限制。

花药培养形成的再生植株基本上源于小孢子脱分化、分化而来，所以在很大程度上，花药对胁迫的培养反应可以视为小孢子的反应。植物对胁迫的反应通常存在交叉适应。已有研究证明植物对生物胁迫和非生物胁迫的反应之间存在交叉适应。NaCl胁迫筛选也是一种对毒素胁迫存活苗的再次逆境选择。

因此，本申请第一方面提供一种筛选麦类作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，该方法包括：

1)取麦类作物幼穗花药置于添加3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇提取液中培养1-3天；

2)由步骤1)处理后的花药分离获得小孢子；

3)将步骤2)获得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.50-1.0×10^-4mol/L、2，4，5-T 0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L，麦芽糖60-120g/L，pH 5.5-6.2的N₆诱导培养基中，获得胚状体；

4)将步骤3)获得的胚状体置于添加NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT 0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，PH为5.5-6.2的2/3MS分化培养基中，获得再生植株，该再生植株为耐赤霉病菌粗毒素的麦类作物。

在一优选实施例中，在所述步骤1)前，先在0-8℃下处理所述麦类作物幼穗花药15-30天。

在另一优选实施例中，在3-5℃下处理所述麦类作物幼穗花药20天。

在一优选实施例中，所述方法还包括：

5)将步骤4)所得的再生植株转入添加有NAA 0.02-0.08mg/L、多效唑2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L，pH5.6-6.0的1/2MS生根壮苗培养基中，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。

在一优选实施例中，所述方法包括：

1)从供体植株上取幼穗在5℃的低温下处理20d，灭菌后在超净台上分离出花药；

2)将步骤1)所得花药置于添加1.5×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.3M甘露醇预处理/提取液中培养2d，获得粗毒素胁迫处理过的花药；

3)将步骤2)获得的花药在超净台上进行旋切分离，获得游离小孢子；