[发明专利]一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法

权利要求书

1.一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法，其特征在于，包括以 下步骤：

1)菌体的培养与收集：挑取苏云金芽胞杆菌的单菌落于5-10ml LB液 体培养基中30℃振荡培养过夜，1wt％转接到50-100ml新鲜LB液体培养基 中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD₆₀₀＝0.9-1.1，收集80-120mg菌体于 1.5ml离心管中；

2)原生质体的制备：向收集的菌体中加入1-1.2ml预冷的溶液A悬浮细 胞，12000g离心，去上清；菌体重悬于200-300μl溶液B，37℃温育1.5-2h；

3)细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的原生质体中加入200-300μl溶 液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100-150μl溶 液D，轻轻混匀，于-20℃中放30min；4℃12000g离心20min，将上清液转 移至新1.5ml离心管内，加入1ml无水乙醇，-20℃过夜；4℃12000g离心20 min，弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入200μl无菌纯水溶 解沉淀；

4)质粒的纯化：向上述DNA溶液中加入150-250μl的溶液E，轻轻混匀； 再加入150-250μl的Tris饱和酚，轻轻混匀；加入150-250μl的氯仿/异戊醇， 轻轻混匀；12000g离心3min，小心将上层水相转移到一个新的离心管中， 加入800μl无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min；12000g离心10min，弃上 清，70wt％乙醇洗涤沉淀，室温晾干；加入40-70μl溶液F，室温放置10min；

所述溶液A是由20-30mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、30-50mM NaCl组 成，pH＝8.0；

所述溶液B是由溶液A中含20wt％蔗糖、2mg/ml溶菌酶和10μg/ml RNase酶组成；

所述溶液C是在溶液A中加入8wt％SDS溶液；

所述溶液D是3M NaAc，pH＝4.8；

所述溶液E是由6.0M NH4Ac和1.0mg/ml溴化乙啶组成；

所述溶液F是由5.0-10.0mM Tris-HCl和0.5-1.0mM EDTA组成， pH＝8.0。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿、异戊醇的 体积比为1∶1。