[发明专利]一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在自然界中广泛存在，生 活环境具有极强多样性，存在于土壤、昆虫、仓储农产品、绿色植物叶表以 及水栖环境中。Bt可以产生对多种农业害虫有毒性的晶体蛋白(Insecticidal crystal protein，ICP)，是目前世界上使用范围最广、应用最成功的微生物 杀虫剂，其杀虫基因已成功地应用到转基因抗虫植物中，是转基因抗虫植物 主要的基因来源。目前已经发现Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同 翅目、直翅目、食虫目等多种昆虫具有杀虫活性。ICP蛋白由cry或cyt基因编 码，除极少数cry基因定位于染色体DNA上，绝大部分毒蛋白是由Bt质粒上 的基因编码的。同时，这些质粒还编码苏云金素、beta-外毒素、杀虫晶体蛋 白的调节基因以及结合转移相关基因。苏云金芽胞杆菌一般含有1-17个内生 质粒，包括含有杀虫晶体蛋白的质粒以及一些没有明显表型特征的隐含质 粒，这些质粒大小在2-80MD之间。由于不同分子量的质粒电泳迁移率不同， Bt内生质粒模式可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。对Bt质粒的分析，可以 用来定位苏云金芽胞杆菌质粒编码的cry基因等功能基因，并研究质粒在不 同菌株或不同种之间转移的特点。因此，清晰准确的Bt质粒图谱对菌株的鉴 定以及质粒缺失突变株的分析研究有极其重要的作用。同时，高质量的质粒 DNA是构建DNA文库与克隆质粒编码基因的前提条件。

目前用于细菌质粒DNA抽提的方法不少，如常规的碱裂解法、SDS裂解 法等，但苏云金芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌，胞壁较厚，多数易形成芽孢， 而且含有的质粒大多是低拷贝的大质粒，使用常规的质粒提取方法实验结果 不理想。DNA纯化试剂盒一般只适合于0.5-20kb的质粒，而且成本高，不适 合大量使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒 DNA的方法，以解决现有提取方法存在的质粒DNA质量低、产量不高、重 复性差等缺陷。本发明利用普通琼脂糖凝胶电泳即可分析Bt的大质粒图谱、 且操作简便、安全、质粒图谱清晰、重复性好，为苏云金芽胞杆菌分子生物 学研究创造了有利条件，可同时适用于多种革兰氏阳性细菌质粒DNA的提 取。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种提取苏云金芽胞杆菌质粒DNA的方法，包括以下步骤：

1)菌体的培养与收集：挑取苏云金芽胞杆菌的单菌落于5-10ml LB液 体培养基中，30℃振荡培养过夜，1wt％转接到50-100ml新鲜LB液体基中 继续振荡培养，至细菌生长密度为OD₆₀₀＝0.9-1.1，收集约80-120mg菌体 于1.5ml离心管中。

2)原生体的制备：向收集的菌体中加入1-1.2ml预冷的溶液A悬浮细胞， 12000g离心，去上清，菌体重悬于200-300μl溶液B，37℃温育1.5-2h。

3)细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的原生质体中加入200-300μl 溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞；向裂解液中加入100-150μl 溶液D，轻轻混匀，于-20℃中放30min；4℃12000g离心20min，将上清液 转移至新1.5ml离心管内，加入1ml无水乙醇，-20℃过夜；4℃12000g离 心20min，弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀；加入200μl无菌 纯水溶解沉淀。

4)质粒的纯化：向上述DNA溶液中加入150-250μl的溶液E，轻轻混匀； 再加入150-250μl的Tris饱和酚，轻轻混匀；加入150-250μl的氯仿/异戊醇(体 积比1∶1)，轻轻混匀；12000g离心3min，小心将上层水相转移到一个新 的离心管中，加入800μl无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min；12000g离 心10min，弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，室温晾干；加入40-70μl溶液F， 室温放置10min。

其中，上述提取方法中，所述溶液A是由20-30mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、30-50mM NaCl组成，pH＝8.0。

所述溶液B是由溶液A中含20wt％蔗糖、2mg/ml溶菌酶和10μg/ml RNase酶组成。