[发明专利]用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接提取方法

权利要求书

1.一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向0.1-5g土壤样品中加入0.1-5ml预冷的无菌水混匀后，漩涡震荡5-20分钟，然后加入0.1-5ml匀浆缓冲液A，漩涡震荡5-20分钟，低速50-400g室温离心10min，收集上清液转移至另一离心瓶中；

(2)向由上述步骤(1)得到的沉淀物中加入0.2-10mL预冷的匀浆缓冲液B洗涤重悬，漩涡震荡5-20分钟，低速50-400g室温离心10min，取上清液，与步骤(1)所得上清液合并；

(3)将由上述步骤(2)得到的上清液，室温下6000-15000rpm离心10-60分钟以回收菌体细胞；

(4)向由上述步骤(3)得到的菌体细胞中加入1-150ml的洗涤液C，洗涤2-10分钟，室温下6000-15000rpm离心10-60分钟以沉淀菌体细胞；

(5)向由上述步骤(4)得到的菌体细胞加入160μl溶菌酶和20μl蛋白酶K，37℃水浴10-40min，然后加入100-500μl细胞裂解液D到样品中，轻轻颠倒混匀1-10分钟，6000-15000rpm离心5-10min，沉淀碎片；

(6)将由上述步骤(5)得到的上清转移到一个干净的离心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10分钟，8000-15000rpm离心3-10min以沉淀蛋白质；

(7)将由上述步骤(6)得到的上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min；

(8)将由上述步骤(7)得到的混合液加入2ml收集管中的结合柱中，室温放置1-5min，3000-10000rpm离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；

(9)将上述步骤(8)收集管中的结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(10)将上述步骤(9)收集管中的结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，8000-15000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次； 

(11)将上述步骤(10)收集管中的结合柱重新放回收集管，8000-15000rpm离心1-5min；

(12)将上述步骤(11)收集管中的结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I，不要戳破膜，室温放置2min，8000-15000rpm离心1-3min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃；

其中，上述提取方法中，所述匀浆缓冲液A由20-400mM Tris、15-200mM EDTA、50-250mM NaCl、0.5-3％pvpp组成，pH＝6.0-9.0；

所述匀浆缓冲液B由10-200mM Tris、5-100mM EDTA、25-150mM NaCl、0.2-1.5％pvpp组成，pH＝6.0-9.0；

所述洗涤液C为1g/L焦磷酸钠；

所述细胞裂解液D由1wt％SDS、20-60mM Tris、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA组成，pH＝8.0；

所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt％冰醋酸组成；

所述DNA联接液F由6-10M异硫氰酸胍、200-600mM醋酸钾组成，pH为4.5-6.0；

所述洗涤液G由5.5M异硫氰酸胍、23mM柠檬酸钠组成；

所述洗涤液H由70wt％乙醇、200mM醋酸钾组成，pH＝5.0；

洗脱液I为0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0；

所述溶菌酶浓度为50mg/mL，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液B优选由100mM Tris、100mM EDTA、150mM NaCl、1％pvpp组成，pH＝7.5。