[发明专利]用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接 提取方法。

背景技术

大多数土壤微生物似乎极其适应它所处的环境并在一般的实验室条件 下是不能培养的。从自然环境中提取基因组DNA是非常有用的方法，可用 于检测不可培养的微生物，跟踪某些目标菌株或重组基因在自然环境中的行 为；也可以用来揭示植物根际土壤微生物生态系统中的基因的多样性及其随 环境的变化。这就要求从环境样品中抽提和纯化土壤微生物基因组DNA。

基因组DNA提取的主要目标是获得最高的DNA回收，从而从微生物 群落中获得最具代表性的DNA，并进行进一步的分子操作(如PCR、SSCP、 DGGE、TGGE、AFLP等)。但是来自环境中的样品含有非常复杂的成分， 尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中不能去除掉，腐殖质有类似于核 酸的物理化学性质。因此，腐殖质连同被吸附的有机分子一起与DNA共同 被萃取。腐殖酸直接影响后续的PCR扩增、杂交、内切酶消化和细菌转化 等。在大多数宏基因组研究中，分离出不含腐殖质的宏基因组DNA，仍然 是一个难题。此外，细胞裂解后粗提DNA的每一个纯化步骤，例如在DNA 分子研究之前进行的重复性纯化步骤，不可避免的引起了DNA的损失。大 部分基因组DNA间接提取方法全都存在缺陷，例如细胞裂解不完全，DNA 吸附于土壤表层，土壤提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪 切。

因此，需要研究适用于植物根际土壤微生物DNA提取的方便、快捷、实 用的方法，以解决使用常规方法所获得的DNA样品存在腐殖酸等PCR抑制物 以及细胞裂解率低、DNA损失严重等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于评价植物根系微生物群 落多样性的土壤DNA间接提取方法，利用细菌的平均密度(1.1μg/cm³)远小 于土壤矿物质的平均密度(2.6μg/cm³)，在细胞裂解以前对样品进行前处理， 将微生物细胞从它们土壤样品中分离出来，以解决在于土壤微生物细胞裂解 后，由于腐殖质有类似于核酸的物理化学性质，纯化步骤存在腐殖质去除困 难和DNA回收率低等问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA间接提取方法， 包括以下步骤：

(1)向0.1-5g土壤样品中加入0.1-5mL预冷的无菌水混匀后，漩涡震 荡5-20分钟分钟，然后加入0.1-5mL匀浆缓冲液A，漩涡震荡5-20分钟， 低速(50-400g)室温离心10min，收集上清液转移至另一离心瓶中。

(2)向由上述步骤(1)得到的沉淀物中加入0.2-10mL预冷的匀浆缓 冲液B洗涤重悬，漩涡震荡5-20分钟，低速(50-400g)室温离心10min， 取上清液，与步骤(1)所得上清液合并。

(3)将由上述步骤(2)得到的上清液，室温下6000-15000rmp离心10-60 分钟以回收菌体细胞。

(4)向由上述步骤(3)得到的菌体细胞中加入1-150ml的洗涤液C，洗 涤2-10分钟，室温下6000-15000rmp离心10-60分钟以沉淀菌体细胞，其中 洗涤液C为1g/L焦磷酸钠。

(5)向由上述步骤(4)得到的菌体细胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和 20ul蛋白酶K(20mg/ml)，37℃水浴10-40min，然后加入100-500μl细胞 裂解液D到样品中，轻轻颠倒混匀1-10分钟，6000-15000rmp离心5-10min， 沉淀碎片。

(6)将由上述步骤(5)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入 250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10 分钟，8000-15000rmp离心3-10min以沉淀蛋白质。

(7)将由上述步骤(6)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍 体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min。

(8)将由上述步骤(7)得到混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放 置1-5min，3000-10000rmp离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重 新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。