[发明专利]麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法

说明书

技术领域

本发明属草酸脱羧酶的制备领域，特别是涉及一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸 脱羧酶的方法。

背景技术

草酸脱羧酶可以催化草酸脱羧形成甲酸和二氧化碳，因此在酶法检测草酸含量，降解 工业废水中草酸盐，制备低草酸含量食品以及降低人体内草酸浓度等方面具有广阔的应用 前景。彩绒革盖菌作为生产草酸脱羧酶的重要菌种，如何降低其培养成本，大量生产菌丝 体，并诱导菌丝体合成草酸脱羧酶是一项重要课题。由于碳元素是生物体内含量最多的元 素，因此碳源是培养基中用量最大的一种，占生物产品总成本的比例较高，所以通过利用 低成本碳源替代目前使用的纯净葡萄糖能大幅度降低微生物的培养成本。

秸秆是农作物收割后的剩余物，作为农业生产的副产品，农村中每年大量的秸秆主要 用来烧火，或者粉碎后给家畜做饲料用。虽然焚烧后的秸秆可以撒在田里作为肥料，但在 焚烧过程中产生的气体会导致温室效应的增加，而且产生的烟尘也会造成空气污染。所以， 将秸秆水解后获得的水解液来作为培养工业微生物的碳源，不仅可以降低微生物培养成 本，减轻焚烧对环境的污染，而且提高了秸秆应用附加值，具有重大的经济效益和环境效 益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的 方法，该方法简单，成本低，效率高；底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。

本发明的一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括：

(1)将粉碎的麦秆按照固液比为1g∶5-15ml用酸溶液浸泡10-20h，在100-150℃条 件下水解反应20-60min，离心去除残渣后，得到麦秆水解液，并用DNS法测定水解液中 还原糖含量(以葡萄糖为标准糖计)；

(2)按7-30g/L的还原糖量，将麦秆水解液配制成发酵培养基，调节pH值为4.0-5.0， 过滤除去杂质，并添加氮源和无机盐，再检查并调节pH值至4.0-5.0，灭菌后备用；

(3)取2-3片直径为9～11mm含菌丝体的琼脂固体培养基，接入液体种子培养基，于 30℃静置培养4-6天；待菌丝体在液体培养基上方形成白色菌丝群但尚未浮出水面时，将 菌丝体和培养基全部转移到含有无菌玻璃珠的容器中，对菌丝体进行震荡破碎获得含有菌 丝碎片的悬浊液，以3-15％的接种量接入上述发酵培养基，在20-30℃和100-250rpm转速 条件下培养4-6天；

(4)待菌丝球形成时，加入终浓度为5-20mM的草酸诱导草酸脱羧酶的产生，培养 0.5-6天后获取菌丝体；菌丝体经液氮冷冻后研磨破碎，用0.2M，pH 3.7的醋酸缓冲液提 取菌丝碎片，离心去除残渣，所得上清液即为草酸脱羧酶粗酶液。

所述步骤(1)中的酸为硫酸、盐酸或醋酸，质量百分比浓度为0.5％-8％；

所述步骤(2)用氢氧化钠溶液调节pH值；

所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：麦秆水解物中的还原糖7～30g(以葡萄糖 为标准糖计)，蛋白胨3.0g，KH₂PO₄ 1.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g以 及微量元素1ml，用水定容至1L；

所述的微量元素的组分为：FeSO₄·7H₂O 10g，MnSO₄·H₂O 1.0g，ZnSO₄·7H₂O 1.0g， CuSO₄·5H₂O 2.0g，CaCl₂·2H₂O 13g，用水定容至1L；

所述步骤(3)中的液体种子培养基，以葡萄糖代替发酵培养基中的还原糖，其余组 分含量与发酵培养基相同。

本发明通过水解麦秆获得培养彩绒革盖菌生长的碳源，并用底物草酸诱导菌丝体合成 草酸脱羧酶。

有益效果

(1)本发明利用麦秆水解液作为发酵培养彩绒革盖菌的碳源，方法简单，易于操作；

(2)本发明使用的麦秆产量大，成本低，作为生产碳源的原料价格低廉；且碳源的制备 可控性强，含糖量稳定；