[发明专利]一种流产鹦鹉热衣原体疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗以及这种疫苗的制备方法，确切讲本发明是一种牛流产鹦鹉热衣原体的亚单位疫苗。

背景技术

动物衣原体病是一种慢性传染病，广泛存在于世界各地，一般呈现地方性或局部地区流行，虽然该病不像一类传染病那样传播迅速，但是在发病地区所造成的危害并不亚于一些烈性病，尤其在现代集约化条件下饲养的家禽和家畜。

早在二十世纪二十年代，美国人(1923)首先报道了牛地方流行性流产综合征；到1956年，德国人采用血清学实验和细胞培养技术，证明原联邦德国奶牛流行性流产是由衣原体感染所致。以后欧洲许多国家，加拿大、前苏联、日本、印度也相继报道牛衣原体性流产。

1978年，首次确诊国内存在山羊和绵羊衣原体性流产。1987年至1989年，农业部组织在22个省开展羊衣原体病调查，用间接血凝试验检测山羊、绵羊血清约18万份，检出阳性羊1.1万份，平均阳性率6.22％，调查表明各省(市)均存在该病。

中国从八十年代，一些省区陆续报道由衣原体引起的牛地方流行性流产综合征，一些省区(湖南、四川等)对牛衣原体病进行调查，从调查结果看，奶牛本病的感染率高于黄牛或水牛。1997-1998年，兰州兽医研究所用用间接血凝试验(IHAT)对采自山东、河北、河南、陕西、宁夏、甘肃、青海和四川等8个省区的肉用牛、肉役兼用黄牛和牦牛血清检测衣原体抗体，结果：肉用牛平均阳性检出率为32.6％；肉役兼用黄牛为15.2％；牦牛为18.7％。2001年，兰州兽医研究所对采自广西、安徽和江苏12个县的水牛血清IHAT检测，发现各县水牛群均程度不同的存在衣原体感染，阳性检出率最低的为3.3％，最高为39.3％。2002-2004年，兰州兽医研究所从10个省部分奶牛场采奶牛血清用IHA方法检测衣原体抗体，平均阳性率为21.4％，并且从流产较为严重的陕西、宁夏奶牛场分离到鹦鹉热衣原体。

我国从八十年代开始关注和研究猪衣原体病。近些年来，从各省家畜疫病普查表明，猪衣原体病在我国南方和北方的规模化猪场流行比较普遍，不同年龄、不同品种的猪群均可感染本病，尤其怀孕母猪和新生仔猪更为敏感。

抗衣原体免疫疫苗可以有效预防和控制动物衣原体病，但至今尚无此类疫苗，市场急需各种家畜通用的新型疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种供家畜用的抗衣原体病的疫苗，本发明同时提供这种疫苗用抗原蛋白制备的方法，特别是一种可以大量工程化生产的方法。

本发明的疫苗是用流产嗜性衣原体外膜蛋白A构成的亚单位疫苗。

外膜蛋白A(OmpA)在衣原体外膜中约占60％。OmpA是制备衣原体疫苗的最佳抗原，因为其含有血清特异性中和抗体决定簇，在引起保护性免疫中起关键作用。OmpA含有7个半胱氨酸残基，并且这些半胱氨酸残基在当前发现的衣原体种中是保守的，对二硫键连接OmpA低聚物的形成起重要作用。而这些低聚物对维持衣原体外膜的完整性是必不可少的。衣原体的OmpA、1或2个富含半胱氨酸的大蛋白(60-kDa)(EnvB or Omp2)和1个富含半胱氨酸的小蛋白(12-kDa)(EnvA or Omp3)细胞间广泛的交错联结的二硫键形成巨大的分子网格决定了EB结构的稳定性，由于EB外表面在衣原体感染附着于宿主细胞膜过程中起重要作用，大量衣原体血清学诊断技术和疫苗的研究都聚焦在EB的外膜蛋白上。

本发明的亚单位疫苗中的流产嗜性衣原体外膜蛋白A的制备方法是以从流产嗜性衣原体提取细菌的总DNA为模板，设计两对特异性引物进行套式聚合酶链反应，扩增得到流产嗜性衣原体外膜蛋白A的完整基因(ompA)，将该基因克隆到原核表达载体中，获得重组表达载体；用重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆；将此重组质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达得到疫苗用抗原蛋白。

本发明的亚单位疫苗中的流产嗜性衣原体外膜蛋白A的制备方法中所用的两对引物的两对引物是根据衣原体外膜蛋白保守区域所得，分别是：

第一对引物的上游引物为P15’-GAG GTGAGTATGAAAAAACTC TTG-3’，

第一对引物的下游引物为P25’-CAA GGT TGT AAT CTC TAG GTT TCA-3’；

第二对引物的上游引物为P5：5’-ACG GAA TTC TTG CCT GTA GGG AAC C-3’(含EcoR I酶切位点)