[发明专利]将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法,及其用途

说明书

本申请是申请日为2002年3月28日的中国专利申请02810886.8“将 外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法，及其用途”的分案申请。

本发明得到了国家卫生部基金AI47539的支持，因此，美国政府对 其拥有某些权利。

技术领域

本申请涉及将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法，新融合蛋白及其用 途。

背景技术

很多注意力都集中在产生免疫反应方面。对外源抗原的一种类型的免 疫反应是产生抗体，通常称之为体液免疫。第二种形式的免疫反应是通 过抗原呈递细胞(APC)呈递抗原产生的。这种类型的免疫反应被广义地 称为细胞介导的免疫反应(CMI)，或T细胞反应。尽管这两种类型的免 疫反应都是重要的，最近将主要注意力集中在CMI上。在处理诸如由人 类免疫缺陷病毒(HIV)导致的AIDS的感染性疾病时，未能证实针对所述 病毒及其部分的抗体反应足以产生免疫性。类似地，在处理与很多恶性 肿瘤相关的外源蛋白时，也未能证实所述抗体反应是足够的。因此，将 注意力集中在产生CMI反应方面。

为了诱导CMI，必须将一种抗原结合在APC表面上的主要组织相容性 复合体(MHC)I类或II类分子上。I类分子通常将抗原，如内源蛋白， 所述蛋白来自病毒感染，以及肿瘤抗原呈递到外面。当由宿主I类MHC 编码的分子呈递病原体来源的(或癌)肽表位(通常8-10个氨基酸)时， 抗原特异性T细胞通常能识别受感染的靶细胞(7)。所述表位源于被蛋 白体裂解成小的肽片段的细胞质蛋白。这些片段随后被转运到内质网 (ER)腔中，在这里它们与新合成的MHC-I分子复合，然后转运到细胞 表面，在这里发生T细胞识别(8-13)。细胞外流体中的抗原(外源抗原) 通常不能进入大多数细胞的这种加工区室。因此，用疫苗诱导CMI的一 个主要挑战是，将外源抗原递送到胞质溶胶内，以便由MHC I类分子呈 递。希望能够制备多种感染性疾病，如HIV，以及癌症，如前列腺癌，乳 腺癌和黑素瘤的疫苗。

例如，越来越多的证据表明CMI在控制HIV感染方面发挥重要作用 (Ogg等，Science 279：2103-6(1998)；Schmitz等，Science 283： 857-60(1999)；Brodie等，Nat.Med.5：34-41(1999))。接触过HIV 但是仍然没有被感染的个体，通常具有抗病毒CMI，但是没有抗体反应。 在形成特异性抗体之前，初次感染的病毒血症，是通过病毒特异性细胞 毒性T淋巴细胞(CTL)形成而解决的(Letvin，Science 280：1875-96 (1998))。以上数据表明了CMI在控制HIV感染方面发挥着关键作用。

很多肿瘤与特定蛋白的表达和/或某些蛋白的过量表达相关。例如， 前列腺癌与升高水平的蛋白，如前列腺特异性抗原(PSA)相关。乳腺癌 可能与诸如Her-2，Muc-1，CEA之类的蛋白的表达和/或过量表达相关。 因此，相当大的注意力集中在试图产生免疫反应方面，特别是在治疗所 述恶性肿瘤时产生针对所述抗原的CMI。

产生针对传染性疾病的细胞介导的免疫性的方法包括使用完整的感 染剂，例如，通过制备遗传工程化的失活病毒或使用杀灭的感染剂。另 一种方法是亚基疫苗，它能将一种或多种抗原(而不是完整病毒)呈递 给受治对象。

为了产生CMI，必须将抗原递送到细胞内部。所述细胞对外源蛋白的 吸收很差。因此，优选方法是使用诸如病毒载体、脂质体、裸DNA的方 法或类似方法。不过，所述方法具有诸多缺陷。例如，很多重组病毒在 反复施用时，其本身会产生抗原性反应。由于产生免疫反应的标准形式 通常需要被称为激发的起始注射，和被称为加强的后续注射，以便获得 满意的免疫性，这可能是一个严重问题。另外，尽管大部分注意力一直 集中在改善病毒载体的安全性方面，但是总是存在某些危险。例如，很 多目标群体，如HIV感染的群体可能具有减弱的免疫系统。因此，在很 多个体中是完全安全的某些病毒载体在上述个体内会产生某种程度的危 险。将蛋白递送到细胞内的方法也未能证明像本发明这样完全安全。因 此，需要新的和简单的方法将抗原递送到胞质溶胶内，以便刺激CMI。

为了产生CMI反应，还存在难于测定所述反应的技术问题。