[发明专利]限定的细胞培养表面及其使用方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于培养细胞的限定的(defined)表面。特别是，本发明提供了对在限定的细胞培养表面培养胚胎干细胞和其他成体干细胞所需的材料和方法。

背景技术

人类胚胎干细胞(hES)通常需要基底和培养基以保持无限期自我更新和多能性的特点。最常见的培养hES细胞的基底是生长在组织培养(TC)聚苯乙烯表面或涂覆有细胞外基质(ECM)的TC培养容器，例如：BD Matrigel^TM涂覆的TC培养容器上的不活跃的成纤维细胞饲养细胞的单层。对这两种基底的限定都不佳，并且存在高度的实验变异性。由于人胚胎干细胞(hES)被认为在促进发育生物学知识、药物发现方面具有显著有效的影响，并且在今后的临床应用中可能发挥重要作用，因此鉴定这些细胞在限定的表面上的培养条件是非常重要的。

发明概述

一方面，本发明提供了一种细胞培养基底，包括：具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中所述薄膜包含一种或多种等离子聚合单体；以及在涂覆有薄膜的表面上的涂层，该涂层(coating)从包括一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液(coating solution)中沉积形成，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。

在其他方面，本发明还提供了一种制备细胞培养基底的方法，包括：提供细胞培养表面；将薄膜等离子聚合到该表面上以形成涂覆有薄膜的表面，其中等离子聚合利用一种或多种单体；以及引入涂覆溶液到薄膜涂覆的表面以形成细胞培养基底，该涂覆溶液包括一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。

在某些方面，本发明提供了一种培养干细胞的方法，包括：提供细胞培养基底；将干细胞的悬浮液应用至细胞培养基底；在37℃，含5％二氧化碳的潮湿空气条件中孵育在所述细胞培养基底上的干细胞；以及允许干细胞粘附在所述细胞培养基底上，其中粘附的细胞主要保持在未分化状态。除非在介质中使用特定的分化因子诱导分化(例如：实施例10)。

更有利的一方面，本发明还可能提供了一种使干细胞具有良好的粘附特性、同时又有利于避免干细胞分化的细胞培养基底。

附图简述

图1：比较描述接种于各种基底上的结晶紫染色的人胚胎干细胞(hES)的细胞集落粘附情况：涂覆有细胞外基质，更具体地说，Matrigel^TM，一种复杂的细胞外基质蛋白混合物(图1A)的组织培养(TC)处理的聚苯乙烯培养板，涂覆有人纤维连接蛋白TC处理的聚苯乙烯培养板(图1B)；和涂覆有人纤连蛋白(图1C)和生长介质的等离子聚合培养板。

图2比较在选择的基底上的典型hES细胞的集落形态学：传代18代之后的，涂覆有细胞外基质(如，Matrigel^TM)的TC培养板(图2A)，和涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图2B)。

图3未分化的hES细胞(H9系)的免疫细胞化学染色，其在核内表达OCT-3/4标志蛋白。细胞用生长介质培养，分别在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图3B)和涂覆有细胞外基质(如，Matrigel^TM)的TC培养板(阳性对照，图3A)上培养。

图4生长在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板和涂覆有细胞外基质(如，Matrigel^TM)的TC培养板(阳性对照)上的未分化的hES细胞特异性标志蛋白的表达情况的定量荧光活化细胞分检器(FACS))分析。

图5生长在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板和涂覆有细胞外基质(如：Matrigel^TM)的TC培养板(阳性对照)上的hES细胞形成的胚状体中，种系特异性标志物基因的表达情况的定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR)分析。

图6在hES细胞来源的分化的细胞中，种系特异性标志蛋白的表达情况的免疫细胞化学染色分析。

图7集中于层中的hFN的图像表示及示意图。图7A对涂覆有不同浓度的人纤连蛋白的等离子聚合培养板和TC培养板上结合的纤连蛋白含量的比较，并通过抗人纤连蛋白ELISA检测。图7B在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板上生长3天的hES细胞(H9系)的结晶紫染色。

图8人间充质干细胞(MSC)在含血清的MSC介质中在组织培养培养板(图8A)上和在无血清的MSC介质中在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图8B)上的粘附情况和生长情况的比较。