[发明专利]检测李斯特氏菌溶血素的免疫胶体金试纸及其制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种检测李斯特氏菌溶血素的免疫胶体金试纸及其检测方法，同时还涉及该试纸相关试剂的制备方法。 

(二)技术背景

李斯特氏菌(Listeria)广泛分布于环境中，共包括格氏李斯特氏菌(L.grayi)、无害李斯特氏菌(L.innocua)、伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes，LMO)、墨氏李斯特氏菌(L.murrayi)、斯氏李斯特氏菌(L.seeligeri)、威氏李斯特氏菌(L.welshimeri)七个种。 

李斯特氏菌属代表种是单核细胞增生李斯特氏菌，它是一种能引起人畜共患病和食源性疾病的致病菌。LMO广泛分布于自然界，如普遍存在于农产品、青贮饲料、泥泞及潮湿的土壤以及保存和处理食品的环境中。该菌对环境抵抗力极强，在低温(4℃)、高温(42℃)、酸性环境、低氧浓度和高盐(20％)的情况下都能生长良好并产生致病力。因此在一般食品、食品加工环境以及家用冰箱中可存活相当长时间。LMO不仅经常出现在生的动物或植物性食物、青贮饲料，在许多熟食或加工食品如低温杀菌牛奶、奶酪和冰淇淋、烟熏的鱼或肉类制品中都可发现其踪迹。该菌属于细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌，目前已证实可感染40多种动物，人畜感染后，主要表现为脑膜炎、败血症和血液中单核细胞增多等症状，死亡率达20％-30％，对畜牧业的发展造成了十分严重的危害。而产李斯特氏菌溶血素存在于食品中可引起人的食物中毒，可引起菌血症及脑膜炎，对孕妇会导致流产，对人和动物的健康构成了严重的威胁。目前检测LMO常用的方法主要包括：传统的微生物学方法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR和核酸探针检测技术。传统的微生物学方法是将分离纯培养后的可疑菌落进行生化反应、动物实验、典型运动等鉴定，被确定为LMO后进一步进行血清型分析。该方法是目前较为通用的方法，其特点是准确、操作简单，但是需要时间较长，且结果误差较大，人力物力花费较大，不适应实际应用中快速检测的需要。免疫荧光法中常因为荧光抗体不够稳定，且判定主观性较强，易出现交叉反应，所以应用时有许多局限性。ELISA法是近年来被广为用作定性或半定量检测的快速检测方法，虽然在一定程度上缩短了检测时间，但仍然需要专门的仪器(如酶标仪)，操作过程仍较复杂。PCR和核酸探针检测技术灵敏度高，结果可靠，但测定方法繁琐、费时，效率低、成本高，常受到食品基质、培养基成分和杂菌的干扰，操作人员需要经过专业培训，难以普及。这些方法，须作较多的生化试验或动物实验才能把病原性李斯特菌从样品中鉴别出来。更为主要的是，以上检测方法均为实验室依赖程度较高，需要专门的设备，对操作人员的专业技能要求较高，限制了推广使用。 

李斯特菌溶血素(Listeriolysin O，LLO)，由hly基因编码的分子量为58.6kDa的溶细胞素蛋白，属于结合胆固醇活化巯基的细胞溶血素家族，是LMO分泌的主要毒力因子，它的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失，它可以损伤红细胞、巨噬细胞(裂解溶酶体膜和吞噬体膜)和血小板。不产生LLO的LMO突变株虽可在非吞噬细胞的胞液中生存一段时间，但却不能繁殖，并且因无法逃逸吞噬体而不能使其他细胞感染，除此之外，LLO还参与了同LMO致病性有关的其它反应。 

除LMO外，伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌也可以分泌LLO。 

免疫层析技术是近年来发展起来的一种简易快速的免疫学检测技术，是以胶体金为标记物的快速免疫结合试验，抗原、抗体在NC膜上进行反应。该技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简易快捷、操作简便、快速、结果直观、无须仪器设备等优点，也不需要进行专业培训即可操作，同时减轻操作人员的劳动强度，具有广泛应用价值。 

本发明以李斯特氏菌特有的标志性毒力蛋白——李斯特氏菌溶血素(Listeriolysin O，LLO)作为检测对象，可以检测样品中存在的毒素，也可用于李斯特氏菌的检测，并可克服传统方法中以病原菌菌体结构成分作为检测对象所出现的与其他相关细菌所发生的交叉反应，同时以毒力标志基因及其产物作为检测对象避免了动物毒性试验检测周期长，动物个体差异大，结果不稳定等弊端。结合胶体金免疫层析技术使本发明的检测方法更加特异、快速，针对性强，实用和方便。 

(三)发明内容