[发明专利]生产含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法

权利要求书

1.用于生产经纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：

(i)在适合于表达所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的条件下在培养基中培养表达所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的宿主细胞；

(ii)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分培养基；并且

(iii)从培养基中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；

其中在步骤(iii)中pH具有在4.5和6.9之间的值或具有在8.6和10之间的值。

2.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)中游离钙离子浓度高于1.2mM。

3.权利要求2的方法，其中在步骤(iii)中所述游离钙离子浓度高于1.3mM，例如高于1.4mM、例如高于1.5mM、例如高于1.6mM、例如高于1.7mM、例如高于1.8mM、例如高于1.9mM、例如高于2.0mM、例如高于2.1mM、例如高于2.2mM、例如高于2.3mM、例如高于2.4mM、例如高于2.5mM、例如高于2.6mM、例如高于3.0mM、例如高于4.0mM、例如高于5.0mM、例如高于6.0mM、例如高于7.0mM、例如高于8.0mM、例如高于9.0mM、例如高于10.0mM、例如高于20mM、例如高于40.0mM、例如高于60.0mM、例如高于80.0mM、例如高于0.1M、例如高于1M、例如溶液饱和状态下的游离钙离子浓度。

4.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)中游离钙离子浓度低于0.10mM。

5.权利要求4的方法，其中在步骤(iii)中所述游离钙离子浓度低于0.09，例如低于0.08、例如低于0.07、例如低于0.06、例如低于0.05、例如低于0.04、例如低于0.03、例如低于0.02、例如低于0.01、例如低于0.00。

6.权利要求1到5中任一项的方法，其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0.025mM.。

7.权利要求6的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Sm²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Sm²⁺和Uo²⁺。

8.权利要求7的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg²⁺、Cu²⁺和Mn²⁺。

9.权利要求6到8中任一项的方法，其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的所述游离离子浓度高于0.025mM，例如高于0.03mM、例如高于0.035mM、例如高于0.04mM、例如高于0.045mM、例如高于0.05mM、例如高于0.055mM、例如高于0.06mM、例如高于0.1mM、例如高于0.15mM、例如高于0.2mM、例如高于0.25mM、例如高于0.3mM、例如高于0.5mM、例如高于1.0mM。

10.权利要求1到9中任一项的方法，其中在另外的二价金属离子螯合剂存在的情况下于步骤(iii)中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。

11.权利要求1到10中任一项的方法，其中pH在4.5和6.9之间于步骤(iii)中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。

12.权利要求11的方法，其中pH在4.7到6.8之间、例如在4.9和6.7之间、例如在5.1和6.6之间、例如在5.3和6.5之间、例如在5.5和6.4之间、例如在5.7和6.3之间、例如在5.8和6.2之间、例如在5.9和6.1之间、例如6.0左右。

13.权利要求1到10中任一项的方法，其中pH在8.6和10之间于步骤(iii)中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。