[发明专利]生产含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法

说明书

发明领域

本发明涉及生产、纯化和配制蛋白酶蛋白的方法。

发明背景

许多涉及凝血级联反应的蛋白，包括，例如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和因子XIII，被证明是有用的医治各种病理学状况的治疗药物。通常，参与被称作凝血“级联反应”的血液组份是酶原或酶原(zymogens)，所述酶原是可通过激活剂作用转化成蛋白水解酶的酶促无活性蛋白，所述激活剂自身就是被激活的凝血因子。从事这类转化的凝血因子通常称为“激活因子”，并且通过加上小写字母“a”作后缀来表示(例如，激活因子VII(FVIIa))。

因为使用人血浆作为药物产品来源有许多不利方面，所以优选地用重组系统生产这些蛋白。然而，凝血蛋白要经受各种翻译中和翻译后修饰，包括，例如，天冬酰胺连接的(N-连接的)糖基化；O-连接的糖基化和谷氨酸的γ-羧化作用。由于这个原因，优选地在哺乳动物细胞中生产这些蛋白，所述哺乳动物细胞可以正确地修饰所述重组蛋白。

在从微生物或细胞系培养物生产凝血蛋白的过程中，最终的生产步骤是回收和任意浓缩目的产物。除了其它污染物例如培养成份、核酸等，细胞生长和含有分泌蛋白的培养基以及特别是含有细胞内目的蛋白的细胞裂解物也或多或少地含有由所述细胞生产的其它蛋白。为了获得纯化的蛋白产物，因而必需将所述目的蛋白从存在于含有所述目的蛋白的粗材料中的其它蛋白和多肽以及其它杂质中分离出来。

美国专利5,700,914涉及用于FVII纯化的方法，其中锌至少存在于其中的一步纯化步骤中。

在传统的培养、纯化步骤和传统的配制过程中，由于激活的凝血蛋白的蛋白酶解功能使所述蛋白易于自降解。因而，在本领域需要改进用于培养、纯化和配制被激活的凝血蛋白的方法以在生产凝血蛋白特别是重组人因子VII或因子VII相关多肽的过程中减少其自身降解。

发明简述

本发明在广义上涉及蛋白酶的纯化。此处描述的方法可用于纯化包括凝血因子FXII/FXIIa、FXI/FXIa、FX/FXa、FIX/FIXa、FVII/FVIIa、凝血酶以及抗凝血蛋白C在内的任何蛋白酶。优选地所述方法用于纯化在细胞培养条件下产生的重组蛋白酶。优选地所述方法用于纯化含有GLA(γ-羧基谷氨酸)残基的丝氨酸蛋白酶、维生素K依赖性凝血因子VIIa、IXa、Xa、活化蛋白C和凝血酶。

更优选地含有具有GLA(γ-羧基谷氨酸)残基的结构域的丝氨酸蛋白酶是因子IX多肽例如FIXa。甚至更优选地含有具有GLA(γ-羧基谷氨酸)残基的结构域的丝氨酸蛋白酶是因子VII多肽例如FVIIa。

本发明的第一个方面涉及用于生产纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：

(i)在适合于表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的条件下在培养基中培养表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的宿主细胞；

(ii)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分培养基；并且

(iii)从所述培养基中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；

其中在步骤(iii)中的游离钙离子浓度高于1.2mM或低于0.10mM；和/或

其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属离子的游离离子浓度高于0.025mM；和/或其中在步骤(iii)中pH低于7.5或高于8.6。

本发明的第二个方面涉及用于生产纯化的因子VII多肽的方法，所述方法包括：

(i)在适合于表达因子VII多肽的条件下在培养基中培养表达因子VII多肽的宿主细胞；

(ii)回收包含因子VII多肽的所有或部分培养基；并且

(iii)从所述培养基中纯化因子VII多肽；

其中在步骤(iii)中游离钙离子浓度高于1.2mM或低于0.10mM；和/或其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属离子的游离离子浓度高于0.025mM；和/或其中在步骤(iii)中pH低于7.5或高于8.6。

本发明的第三个方面涉及用于生产纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：

(i)在适合于表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的条件下在培养基中培养表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的宿主细胞；

(ii)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分培养基；并且

(iii)从所述培养基中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；