[发明专利]应用毕赤酵母的pGAP调控表达转酮醇酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种应用毕赤酵母的pGAP启动子调控生产生物蛋白的方法，具体是一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达转酮醇酶的方法。

背景技术

转酮醇酶(transketolase EC 2.2.1.1)，亦称转羟乙醛酶或酮基移换酶。转酮醇酶广泛存在于微生物界，现已知产转酮醇酶的微生物有某些细菌、真菌和弧菌等。木糖是半纤维素的主要组成成分，在植物纤维材料水解液中占30％左右，是仅次于葡萄糖的自然界最丰富的糖分。利用微生物发酵转化木糖生产乙醇是当前的研究热点之一。能够高效酿酒的微生物(例如酿酒酵母和运动发酵单孢菌)都不具备直接利用木糖生成酒精的能力，必须经过系列酶的作用才能将木糖转化成为能被酿酒微生物能够利用生成酒精的物质，而转酮醇酶是这一系列的转换木糖作用途径中的关键酶。因此，转酮醇酶在利用植物半纤维素生成乙醇方面有意义。目前所应用的转酮醇酶主要是以天然的含转酮醇菌株进行发酵生产的。但是，由于天然的转酮醇酶菌株的生长缓慢，生产周期长，调控基因的启动子的强度低致使产物量少，使生产成本较高，不利于转酮醇酶的规模化生产和利用。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，由于Pichiapastoris分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是Pichia pastoris的组成型强启动子，与Pichia pastoris的pAOX1(醇氧化酶1启动子)相比其优越性主要是不需要有毒性的甲醇作为碳源。

发明内容

本发明的目的是为解决应用天然的转酮醇酶菌株的生长缓慢，营养要求较高，使转酮醇酶生产成本较高的问题，而提供一种应用毕赤酵母的pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)调控表达转酮醇酶的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达转酮醇酶的方法，其步骤是：

1、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；

2、在转酮醇酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控转酮醇酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；

3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；

4、将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵工程菌1～2d分泌表达转酮醇酶。所述液体培养基是由以下组分组成：85％磷酸25～28ml/L，CaSO₄·2H₂O 0.8～1.2g/L，K₂SO₄ 17～19g/L，MgSO₄·7H₂O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM43～5ml/L。所述PTM4是由以下组分组成：CuSO₄·5H₂O 2.0g/L，NaI·2H₂O0.1g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，CoCl₂·6H₂O 1.05g/L，ZnCl₂ 7.0g/L，Fe₂(SO₄)₃·7H₂O 22g/L，生物素0.2g/L，硫酸1ml/L。

所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。

本发明采用了毕赤酵母的pGAP调控表达的转酮醇酶，具有下列优点：

1、生产成本低，只需使用普通的无机盐、碳源和氮源作为发酵培养基。

2、可在生物反应器中发酵毕赤酵母，其细胞能生长至细胞密度达200A以上，能以足够多的细胞数量表达转酮醇酶，有利于转酮醇酶的大规模生产。

3、发酵周期短，整个发酵周期只需1～2d。

4、使用无毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作为碳源，无毒副作用。