[发明专利]侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法

权利要求书

1.侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：

①根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nucleotide)上已报道的番茄黄化曲叶病毒核酸序列(GU111505)和中国番木瓜曲叶病毒核酸序列(EU874386)设计引物，引物序列如下：

PA_F362：5`-GCACCACTCACATTCTCGGAAAC-3`

TY_F833：5`-GGTCTACACGCTTACGCCTTATT-3`

PATY_R：5`-TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3`

②引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：

引物组合          检测病毒名称          目的片段大小

PA_F362/PATY_R    中国番木瓜曲叶病毒    362bp

TY_F833/PATY_R    番茄黄化曲叶病毒      833bp

(2)总DNA提取：

取10mg番茄病叶于1.5mL离心管，加100μL0.5mol/LNaOH，匀浆后5000rpm离心5min，上清液用0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)稀释100倍，取1μL作为模板进行PCR扩增。

(3)PCR扩增：

PCR反应体系包括：

DNA                  1μL

10×PCR缓冲液        2.5μL

dNTPs(10mM/dNTP)     0.5μL

PA_F362(10μmol/L)   1μL

TY_F833(10μmol/L)   1μL

PATY_R(10μmol/L)    1μL

TaqDNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL

ddH₂O                17.5μL

总体积               25μL

反应条件为94℃预变性10min；94℃变性45sec、53-59℃退火45sec、72℃延伸1min，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

(4)电泳检测：

取10μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染番茄黄化曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条833bp的核酸条带，在仅感染中国番木瓜曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条362bp的核酸条带，在同时感染番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到362bp和833bp两条核酸条带。

2.根据权利要求1所述的快速鉴别侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的方法，其特征在于PCR扩增中的退火温度为55-57℃。

3.根据权利要求1所述的快速鉴别侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的方法，其特征在于PCR扩增的循环次数为32-35次。