[发明专利]侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对番茄上两种病毒(番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒)快速鉴别的方法，属植物保护领域。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄上一种危害异常严重的病毒，分类上属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，传播介体为烟粉虱(Bemisiatabaci)，病毒基因组为单链环状DNA，大小2.7-2.8kb。该病毒感染番茄后症状主要表现叶片变小，上卷，叶缘及叶脉之间黄化，植株生长迟缓，节间变短，矮化，上部呈簇生状，对番茄的产量和质量影响极大，重病田常造成绝产绝收。20世纪90年代，该病在多米尼加共和国导致当地番茄产量损失95％；本世纪初，我国的海南、台湾、广东、云南等南方地区番茄上就有该病发生危害的报道，2006-2009年该病陆续在浙江、上海、江苏、安徽、山东、河北等地爆发，给当地的番茄生产造成了严重的损失，其中浙江温州地区5000余亩番茄被毁。由于该病毒蔓延迅速、危害惨重、控制困难，已上升为当前我国番茄生产上的主要限制因素之一。

中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl china virus，PaLCCNV)也属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，传播介体为烟粉虱，病毒基因组为单链环状DNA，大小2.7-2.8kb。该病毒最早是在我国广西的番木瓜上检测到的，所以称为中国番木瓜曲叶病毒，其危害番茄主要表现叶片变小，上卷，叶缘及叶脉之间黄化，植株矮化，对番茄的产量和质量影响严重。2007年该病在河南番茄上大面积发生危害，仅开封市开封县就有2000个日光温室受到毁灭性的危害，直接经济损失近2000万元。2009年在安徽、江苏等地的番茄上也陆续检测到了该病毒，显示该病毒也有蔓延扩散的迹象，是我国当前番茄生产上一个潜在的威胁。

由于两种病毒有着相似的粒体形状，相同的传播介体及相近的基因组结构，侵染番茄后的田间症状也非常相近，由此也为其鉴别带来了很大的困难。

目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有：生物学接种法，血清学检测法，电镜观察及分子生物学方法。由于这两种病毒在很多方面都具有非常接近的特性，因此传统的植物病毒检测方法，如电镜观察(病毒粒子大小形状相近)、生物学接种鉴定(症状类似、介体相同、周期长)、血清学检测(属于同一个属，序列有很高的同源性，血清学相关)等方法都很难区分。目前在这两种病毒的检测上都是采用分子生物学的方法，需要获得其序列进行同源比对后才能区分，尚未见到使用PCR即可区分这两种病毒的方法。本方法针对当前这两种病毒在我国的危害现状，根据其序列特征，设计优化引物，只需一次PCR即可实现两种病毒的鉴别，为当前这两种病毒的田间调查及今后的预测预报提供了较为简单的方法。该方法是一种基于PCR的分子检测方法，保证了灵敏性和特异性，同时该方法通过引物的优化设计，简化了操作，节省了成本。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，为侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的鉴别提供了一种快速、简便、灵敏、特异的方法。

1、引物设计：

(1)根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nucleotide)上已报道的番茄黄化曲叶病毒核酸序列(GU111505)和中国番木瓜曲叶病毒核酸序列(EU874386)设计引物，引物序列如下：

PA_F362：5`-GCACCACTCACATTCTCGGAAAC-3`

TY_F833：5`-GGTCTACACGCTTACGCCTTATT-3`

PATY_R：5`-TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3

(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：

引物组合          检测病毒名称          目的片段大小

PA_F362/PATY_R    中国番木瓜曲叶病毒    362bp

TY_F833/PATY_R    番茄黄化曲叶病毒      833bp

2、总DNA提取：

取10mg番茄病叶于1.5mL离心管，加100μL 0.5mol/L NaOH，匀浆后5000rpm离心5min，上清液用0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)稀释100倍，取1μL作为模板进行PCR扩增。

3、PCR扩增：

PCR反应体系包括：