[发明专利]一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用

权利要求书

1.一种长PCR步移试剂盒，其特征在于包括：（1）试剂A：其中，每9.25~12.5μL 试剂A中包含10mmol/L的dNTP1~3μL，25mmol/LMgCl₂3~4μL，10×PCR缓冲液5μL及LA Taq酶0.25~0.5μL；（2）试剂B：ddH₂O5~20mL；（3）试剂C：琼脂糖5~20g；（4）试剂D：6×PCR上样缓冲液1~5 mL；（5）试剂E：核酸染料20~100μL；（6）试剂F：50×电泳缓冲液10~20 mL；（7）引物11条，序列如SEQ ID NO:1~11所示，每条各10~50μL；

所述引物SEQ ID NO:1~10长39~40碱基，其5’端包含29个固定碱基，3’端包含6~7个随机设计的碱基，GC≥50%，中间区域为4个完全简并的碱基NNNN。

2.根据权利要求1所述的长PCR步移试剂盒，其特征在于所述6×PCR上样缓冲液的成分为：EDTA20~30mmol/L，甘油30~40体积%，二甲苯青0.0004~0.0008g/ml和溴酚蓝0.0004~0.0006g/ml。

3.根据权利要求1所述的长PCR步移试剂盒，其特征在于每1L 50×电泳缓冲液中含三羟甲基氨基甲烷242g，EDTA37.2g，醋酸57.1mL。

4.权利要求3所述的长PCR步移试剂盒的使用方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）DNA提取；

（2）第一轮长PCR步移：根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引物P，长18~22bp，浓度为1~2μmol/L，当反应体系为25μL时，加入试剂A4.2~6.25μL，上游引物P0.5~1.0μL，DNA模板0.5~2.0μL，余量为试剂B；

（3）第一轮长PCR步移扩增程序：92~94℃预变性2~5min，92~94℃变性15~30s，56~60℃退火30~60s，68~72℃延伸3~10min，共进行30个循环后，将反应体系降温到4~12℃，维持5~30min，在维持期间，迅速加入引物各0.5~1.0μL，引物序列如SEQ ID NO:1~10所示；加入引物后再进行一个循环，该循环程序为：80~86℃变性15~40s，36~43℃变性1~3min，68~72℃延伸3~10min，68~72℃延伸5~8min；所得PCR产物取1μL，加入试剂B，稀释10~30倍，作为第二轮长PCR的DNA模板；

（4）第二轮长PCR步移：根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引物Q，长26~29bp，浓度为10~20μmol/L，当反应体系为25μL时，加入试剂A4.2~6.25μL，上游引物Q0.5~1.0μL，序列如SEQ ID NO:11所示的引物0.5~1.0μL，步骤（3）稀释得到的DNA模板0.5~2μL，余量为试剂B；PCR反应对照组中，加入试剂A4.2~6.25μL，序列如SEQ ID NO:11所示的引物0.5~1.0μL，步骤（3）稀释得到的DNA模板0.5~2μL，余量为试剂B；

（5）第二轮长PCR步移扩增程序：92~94℃预变性2~5min，92~94℃变性15~30s，68℃变性并延伸3~10min，共30个循环，最后68℃延伸5~8min；

（6）PCR步移产物检测：取第二轮长PCR步移产物及对照组PCR产物各3~5μL，加入0.5~1μL试剂D混合，上样琼脂糖凝胶，将试剂F用去离子水稀释50倍用作电泳缓冲液，电压100~140V，电泳20~40min；电泳结束后紫外成像，胶样中，实验组出现而对照组中不出现的条带即为阳性的PCR步移片段。

5.根据权利要求4所述的长PCR步移试剂盒的使用方法，其特征在于步骤（6）中，每100mL琼脂糖凝胶含有试剂E1~5μL。 

6.根据权利要求4或5所述的长PCR步移试剂盒的使用方法，其特征在于步骤（6）中所述阳性PCR步移片段用于下游PCR产物测序或克隆测序。

7. 权利要求1~3中任意一个权利要求所述的长PCR步移试剂盒的应用，其特征在于所述长PCR步移试剂盒用于克隆已知DNA片段侧翼的未知序列。