[发明专利]一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用有效
申请号: | 200910214350.7 | 申请日: | 2009-12-29 |
公开(公告)号: | CN101812494A | 公开(公告)日: | 2010-08-25 |
发明(设计)人: | 罗鹏;苏婷;任春华;胡超群 | 申请(专利权)人: | 中国科学院南海海洋研究所 |
主分类号: | C12P19/34 | 分类号: | C12P19/34;C12R1/63 |
代理公司: | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人: | 陈卫 |
地址: | 510301 广东*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 pcr 试剂盒 及其 使用方法 应用 | ||
1.一种长PCR步移试剂盒,其特征在于包括:(1)试剂A:其中,每9.25~12.5μL 试剂A中包含10mmol/L的dNTP1~3μL,25mmol/LMgCl23~4μL,10×PCR缓冲液5μL及LA Taq酶0.25~0.5μL;(2)试剂B:ddH2O5~20mL;(3)试剂C:琼脂糖5~20g;(4)试剂D:6×PCR上样缓冲液1~5 mL;(5)试剂E:核酸染料20~100μL;(6)试剂F:50×电泳缓冲液10~20 mL;(7)引物11条,序列如SEQ ID NO:1~11所示,每条各10~50μL;
所述引物SEQ ID NO:1~10长39~40碱基,其5’端包含29个固定碱基,3’端包含6~7个随机设计的碱基,GC≥50%,中间区域为4个完全简并的碱基NNNN。
2.根据权利要求1所述的长PCR步移试剂盒,其特征在于所述6×PCR上样缓冲液的成分为:EDTA20~30mmol/L,甘油30~40体积%,二甲苯青0.0004~0.0008g/ml和溴酚蓝0.0004~0.0006g/ml。
3.根据权利要求1所述的长PCR步移试剂盒,其特征在于每1L 50×电泳缓冲液中含三羟甲基氨基甲烷242g,EDTA37.2g,醋酸57.1mL。
4.权利要求3所述的长PCR步移试剂盒的使用方法,其特征在于所述方法包括如下步骤:
(1)DNA提取;
(2)第一轮长PCR步移:根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引物P,长18~22bp,浓度为1~2μmol/L,当反应体系为25μL时,加入试剂A4.2~6.25μL,上游引物P0.5~1.0μL,DNA模板0.5~2.0μL,余量为试剂B;
(3)第一轮长PCR步移扩增程序:92~94℃预变性2~5min,92~94℃变性15~30s,56~60℃退火30~60s,68~72℃延伸3~10min,共进行30个循环后,将反应体系降温到4~12℃,维持5~30min,在维持期间,迅速加入引物各0.5~1.0μL,引物序列如SEQ ID NO:1~10所示;加入引物后再进行一个循环,该循环程序为:80~86℃变性15~40s,36~43℃变性1~3min,68~72℃延伸3~10min,68~72℃延伸5~8min;所得PCR产物取1μL,加入试剂B,稀释10~30倍,作为第二轮长PCR的DNA模板;
(4)第二轮长PCR步移:根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引物Q,长26~29bp,浓度为10~20μmol/L,当反应体系为25μL时,加入试剂A4.2~6.25μL,上游引物Q0.5~1.0μL,序列如SEQ ID NO:11所示的引物0.5~1.0μL,步骤(3)稀释得到的DNA模板0.5~2μL,余量为试剂B;PCR反应对照组中,加入试剂A4.2~6.25μL,序列如SEQ ID NO:11所示的引物0.5~1.0μL,步骤(3)稀释得到的DNA模板0.5~2μL,余量为试剂B;
(5)第二轮长PCR步移扩增程序:92~94℃预变性2~5min,92~94℃变性15~30s,68℃变性并延伸3~10min,共30个循环,最后68℃延伸5~8min;
(6)PCR步移产物检测:取第二轮长PCR步移产物及对照组PCR产物各3~5μL,加入0.5~1μL试剂D混合,上样琼脂糖凝胶,将试剂F用去离子水稀释50倍用作电泳缓冲液,电压100~140V,电泳20~40min;电泳结束后紫外成像,胶样中,实验组出现而对照组中不出现的条带即为阳性的PCR步移片段。
5.根据权利要求4所述的长PCR步移试剂盒的使用方法,其特征在于步骤(6)中,每100mL琼脂糖凝胶含有试剂E1~5μL。
6.根据权利要求4或5所述的长PCR步移试剂盒的使用方法,其特征在于步骤(6)中所述阳性PCR步移片段用于下游PCR产物测序或克隆测序。
7. 权利要求1~3中任意一个权利要求所述的长PCR步移试剂盒的应用,其特征在于所述长PCR步移试剂盒用于克隆已知DNA片段侧翼的未知序列。
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