[发明专利]一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及已知DNA片段侧翼未知序列的克隆领域，具体涉及一种长PCR 步移试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

对于遗传及分子生物学相关研究而言，获取已知DNA序列侧翼未知序列是 一项经常面临的重要任务。比如：在植物功能基因组学中分析T-DNA插入位点； 了解细菌转座子插入位点及携带的外源基因；根据已知的部分基因片段获取全 长的基因；功能基因启动子分析等。传统的获取已知DNA序列侧翼未知序列的 方法是构建文库，然后对文库进行大量筛选。这种方法不仅费时、费力、成本 高，而且最终的结果依赖于构建文库的质量。因此，基于PCR技术的基因组步 移(PCR步移)成为人们感兴趣的目标。目前已经被使用的方法包括：反向PCR、 接头PCR、热不对称交错PCR(Tail-PCR)。尽管这些方法在各自领域都有比较 广泛的使用，但是这些方法在实际应用中都具有各自的缺陷。在PCR操作前， 反向PCR、接头PCR需先对基因组进行酶切，然后进行连接(分子内成环或酶 切片段与接头引物连接)，两种方法对提取基因组的质量要求很高。由于侧翼序 列的未知性通常需要对多个内切酶进行筛选，因此具有盲目性；分子内成环以 及接头连接效率也是构建能用于下一步PCR步移模板的制约因素。因此实际操 作中，一个设计合理的实验方案，往往并不能得到预期的结果，反而增加了操 作时间和耗费。源于半随机引物PCR方法的Tail-PCR是目前在植物基因组应用 非常广泛的扩增未知侧翼片段的方法。但是Tail-PCR设置程序复杂，为了得到 持续稳定且正确的PCR产物，需要对程序条件进行反复设置。此外采用有简并 碱基末端的引物以及Tail-PCR设置程序本身固有的限制，都致使这种方法不能 获得长的侧翼未知片段并且产物具有较多的假阳性。总概上述方法，均存在操 作繁琐、非特异性片段较多、一次步移片段短(小于1.5Kb)的缺陷。这些缺 陷均限制了其更为广泛的应用，尽管获取侧翼未知序列是经常面临的工作。因 此十分有必要探索新的简单、快速、高效PCR步移方法，并开发成商业化的试 剂盒，广泛应用于各类分子生物学实验室。

发明内容

本发明目的在于根据现有技术的不足，提供一种简单、快速、高效的长PCR 步移试剂盒。

本发明另一目的在于提供上述长PCR步移试剂盒的使用方法。

本发明还有一个目的在于阐明上述长PCR步移试剂盒的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种长PCR步移试剂盒，包括：(1)试剂A：其中，每9.25~12.5μL试剂 A中包含10mmol/L的dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)1~3μL，25mmol/L MgCl₂3~4μL，10×PCR缓冲液5μL及LA Taq酶0.25~0.5μL；(2)试剂B： ddH₂O5~20mL；(3)试剂C：琼脂糖5~20g；(4)试剂D：6×PCR上样缓冲 液1~5mL；(5)试剂E：核酸染料20~100μL；(6)试剂F：50×电泳缓冲液 10~20mL；(7)引物11条，序列如SEQ ID NO：1~11所示，每条各10~50μL。

上述6×PCR上样缓冲液的成分为：EDTA20~30mmol/L，甘油30~40体积％， 二甲苯青0.0004~0.0008g/ml和溴酚蓝0.0004~0.0006g/ml。

上述50×电泳缓冲液中，每1L 50×电泳缓冲液中含三羟甲基氨基甲烷242g， EDTA37.2g，醋酸57.1mL。

本发明长步移试剂盒的使用方法由两轮PCR及后续的测序组成，具体步骤 如下：

(1)DNA提取，提取方法为常规方法，对基因组的完整性和纯度没有严 格要求，对基因组的物种来源没有限制；

(2)第一轮长PCR步移：根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引物 P，长18~22bp，浓度为1~2μmol/L，当反应体系为25μL时，加入试剂A4.2~6.25μL， 上游引物P0.5~1.0μL，DNA模板0.5~2.0μL，余量为试剂B；