[发明专利]一种CYP3A4基因SNP检测特异性引物、液相芯片及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及CYP3A4基因SNP检 测特异性引物、液相芯片及方法。

背景技术

细胞色素P450(cytochrome P450，cytochrome CYPs，简称P450)是一类以血红素为辅基 的B族细胞色素超家族蛋白酶，存在于细胞内质网膜上。P450酶系是最重要的一组代谢酶，参 与的代谢包括致癌物质和临床治疗药物等。在CYP450超家族中，CYP1A2，CYP2A6，CYP2C9， CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4与目前市场上95％以上药物代谢及药物间相互作用有关。

CYP3A同工酶参与了烟草致癌物和类固醇代谢，包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和 CYP3A43，在人类肺部组织的表达和活性的转录水平存在显著的个体间差异。其中，CYP3A4 被认为是肝脏和小肠中含量最丰富的CYP，现已发现CYP3A4参与了大约38个类别共150多种药 物的代谢。研究证明CYP3A4的酶活性与肝癌、前列腺癌、白血病等的发生密切相关。此外， 该酶还参与了部分前致癌物质的活化，与之相关的药物相互作用亦十分多见。

目前已报道的CYP3A4等位基因型超过40种，其中CYP3A4*1B是较早发现的突变基因型， 研究证明CYP3A4*1B等位基因存在与启动子活性的提高和晚期前列腺癌直接相关。 CYP3A4*1B等位基因携带者患上非小细胞肺癌风险显著提高，其中，女性携带者患上肺癌的 风险更高。吸烟剂量大的CYP3A4*1B等位基因携带男性比吸烟剂量小的*1A/*1A携带者患上肺 癌的几率更高。CYP3A4*2的分布频率较低，国内暂未发现，有研究证明该突变基因型会导致 人体对硝苯地平的药物清除能力下降；CYP3A4*4、CYP3A4*5和CYP3A4*6是在对中国人群 的研究中首先发现的，均会导致酶活性的下降；有研究发现CYP3A4*17和CYP3A4*18会影响 睾酮的药效，其中CYP3A4*18在中国人群的分布频率达10％；CYP3A4*19在亚洲的分布频率为 2％，主要出现在印度和巴基斯坦一带，CYP3A4*3在中国人中分布频率为1.5％。

CYP3A4基因的多态性是造成个体对药物治疗效果差异的主要原因之一，因此专家建议在药 物使用前对靶标进行检测，使临床医生了解遗传信息，从而有针对性地使用药物和剂量，有效 减少毒副作用和提高药效。

目前国内外检测CYP3A4基因多态性的方法有少量报道，主要建立在传统固相芯片和PCR 的基础上，固相芯片价格昂贵，而且敏感度不高，检测结果的可重复性差。而其它以PCR为基 础的SNPs检测技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测 等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测 通量的局限性不能满足临床的需要，而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分 析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力。

基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技 术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大 分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色 剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋 白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微 球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。 Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球 表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激 光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种 类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通 量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用 xTAG液相芯片技术可以同时检测多种SNPs，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效 率，在同类检测技术中处于领先地位。

发明内容