[发明专利]一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶，其特征在于：该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶是通过以下方法制备的：

a)尖吻蝮蛇蛇毒用磷酸盐缓冲液溶解，离心，上清液上Sephadex G-75凝胶柱，磷酸盐缓冲液洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

b)将a)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰上第一次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含有0-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

c)将b)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第二次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含0.025-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

d)将c)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第三次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含0.025-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰，收集的有效峰经脱盐，冻干后即为该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯品；

该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶为单肽链，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得其精确分子量为31084 Da，SDS-PAGE法测得其分子量为37KDa，其N端44个氨基酸残基序列为VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC，等电点为4.28，最适温度37℃，最适pH6.6，血浆凝结比活为560单位/毫克。

2.权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶在制备止血或预防出血药物中的应用。

3.一种止血或预防出血药物，其特征在于该药物含有权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶作为活性成份。

4.一种制备权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

a)尖吻蝮蛇蛇毒用磷酸盐缓冲液溶解，离心，上清液上Sephadex G-75凝胶柱，磷酸盐 缓冲液洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

b)将a)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰上第一次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含有0-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

c)将b)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第二次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含0.025-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

d)将c)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第三次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含0.025-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰，收集的有效峰经脱盐，冻干后即为该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：具体步骤为：

a)尖吻蝮蛇蛇毒用0.01M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液溶解，离心6000rpm、20min，上清液上Sephadex G-75凝胶柱，用0.01M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

b)将a)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰上第一次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含有0-0.05M NaCl的0.01M、pH值为6.8的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

c)将b)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用0.01M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液透析24h，透析样上第二次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含0.025-0.05MNaCl的0.01M、pH值为6.8的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；

d)将c)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用0.01M，pH值为7.8的磷酸 盐缓冲液透析24h，透析样上第三次DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含0.025-0.05MNaCl的0.01M、pH值为7.8的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰，收集的有效峰经Sephadex G-25凝胶柱脱盐，冻干后即为该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯品。