[发明专利]一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法和应用有效
申请号: | 200910214396.9 | 申请日: | 2009-12-30 |
公开(公告)号: | CN101812436A | 公开(公告)日: | 2010-08-25 |
发明(设计)人: | 唐松山 | 申请(专利权)人: | 唐松山 |
主分类号: | C12N9/64 | 分类号: | C12N9/64;A61K38/48;A61P7/04 |
代理公司: | 广州科粤专利代理有限责任公司 44001 | 代理人: | 余炳和 |
地址: | 510507 广东省广*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 蝮蛇 蛇毒 凝血酶 及其 制备 方法 应用 | ||
技术领域:
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法以及其在制备止血或预防出血药物中的应用。
背景技术:
蛇毒类凝血酶(TLE)是从蛇毒中的一类具有类凝血酶活性的蛋白酶,能特异性地水解纤维蛋白原形成纤维蛋白单体而促使血液凝固。Kornalic F等将以纤维蛋白原为底物的蛇毒酶按其作用机理分成三类:I类是类凝血酶(Thrombin-like enzyme,TLE)或凝血蛋白酶(Thrombicprotease),它仅分解纤维蛋白原的α链和/或β链的N端肽链,释放A肽(α链)和/或B肽(β链),使血液凝固。II类是纤维蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme),它直接从纤维蛋白原三条肽链(α,β和γ)的C端水解,将纤原分解成碎片,血液不被凝固。III类是纤溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen),它是纤维蛋白溶解的间接激活剂,它通过激活纤溶酶原产生纤溶酶,来裂解纤维蛋白或纤维蛋白原。
国内外已经批准用于止血的类凝血酶药物主要是立芷雪。由瑞士巴塞素高大药厂研制的商品名为立芷雪(Reptilase)的止血药物是从巴西蛇毒Bathrops atrox中提取的类凝血酶。由于立芷雪疗效确切,副作用小,临床适应症广,优于其它止血药等特点,于1996年进入中国国家基本药物目录,所以我国每年需从瑞士进口大量立芷雪用于临床。自从立芷雪(Reptilase) 进入中国以来,国内许多研究者都尝试过寻找类似的止血成分。2001年,由沈阳赛诺科技发展有限公司、长春市斯达生物技术有限责任公司和北京赛生科技发展有限公司联合,在国内成功地使用进口巴西Bathrops atrox蛇毒生产立芷雪产品,市场名巴曲停,英文名Hemocoagulase。2005年辽宁锦州医学院牟萍等自长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon blomhoffiiussurensis)蛇毒中提取35.5KDa的具有止血活性的类凝血酶,该类凝血酶N端15个氨基酸残基与立芷雪相同,该类凝血酶仿制立芷雪,被发展成商品名为邦停上市。
尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)又称五步蛇或蕲蛇,分布在华南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性较低,无神经毒和激肽释放酶活性。在其组份中,以纤维蛋白原为底物的酶分布十分丰富,这些酶在体外能使人血浆和牛纤原凝结,但在体内却引起各种不同的生理效应如降纤抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究,最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等,他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组份,经动物实验验证,它们均有不同程度抗凝作用,其中的Acutin分子量41KDa,后被发展成降纤酶。肖昌华等从1988年起和管锦华等从1992年起,也多次尝试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离使动物凝血时间缩短的组份。
发明内容:
本发明的第一个目的是提供一种具有止血活性或者预防出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。
本发明的第二个目的是提供一种制备该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法。
本发明经过以下步骤从尖吻蝮蛇蛇毒中制备尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶:
a)尖吻蝮蛇蛇毒用磷酸盐缓冲液溶解,离心,上清液上Sephadex G-75凝胶柱,磷酸盐缓冲液洗脱,收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰;
b)将a)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰上第一次DEAE-Sepharose FastFlow柱,用含有0-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱,收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰;
c)将b)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析,透析样上第二次DEAE-Sepharose Fast Flow柱,用含0.025-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱,收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰;
d)将c)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析,透析样上第三次DEAE-Sepharose Fast Flow柱,用含0.025-0.05M NaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱,收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰,收集的有效峰经脱盐,冻干后即为该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯品。
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