[发明专利]对虾白斑综合征病毒VP28酵母表面展示与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术，具体地说，本发明涉及对虾白斑综合征病毒结构蛋白VP28酵母表面展示方法，本发明还涉及展示的对虾白斑综合征病毒VP28的生产方法与应用。 

背景技术

对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产养殖业造成严重的经济损失。因此针对对虾白斑综合征病毒的药物开发受到广泛关注。 

对虾为无脊椎动物，不具备特异性免疫系统，但近年的研究表明，对虾存在类免疫(quasi-immune)应答机制，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。目前有关对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导产生高效免疫应答能力的囊膜蛋白进行免疫接种方式来展开。已报道的蛋白类和核酸类WSSV疫苗制剂主要以注射方式为主，难以适应对虾大规模养殖。近年来活疫苗(live vaccine)引起了人们的广泛兴趣，特别是口服活疫苗。现在活的口服疫苗是利用病原菌致病基因、病毒外壳蛋白基因和抗体基因在病毒、细菌和酵母菌细胞中表达，然后被分泌到宿主外表面，并固定在宿主外表面上，利用这种表面展示的活宿主免疫养殖动物，达到防治病害。在这些宿主中，酒精酵母菌是最佳的微生物，以酒精酵母表面展示技术为基础制备的基因工程疫苗在小鼠和人体中已有成功的报道，但在对虾类疫苗的研究中至今还未见报道。 

已知VP28是由病毒基因组自身编码的结构蛋白，为WSSV的主要囊膜蛋白，VP28与对虾白斑综合征的系统感染有关。通过表面展示技术将对虾白斑综合征病毒VP28蛋白展示在酵母细胞表面，使多肽抗原更容易被免疫系统识别，同时酵母细胞表面成分可以起到免疫佐剂的作用。而且酒精酵母菌为食品级微生物，具备安全、容易培养的优点，可以很容易地过渡到廉价的口服疫苗，通过简单而又安全的方式接种。基于酵母细胞表面展示技术的VP28基因工程活载体疫苗，在对虾类疫苗的研究中至今未见报道。 

本发明的目的在于将VP28蛋白展示于酵母细胞表面，构建表面展示对虾白斑综合征病毒VP28蛋白的重组酵母EBY100，并将其用免疫对虾，保护对虾抗对虾白斑综合征病毒的侵染。 

发明内容

本发明的目的是提供一种以酿酒酵母为载体的对虾白斑综合征病毒VP28的展示方法，展示的对虾白斑综合征病毒VP28的重组酵母菌的生产方法，所制备的重组酵母菌作为活疫苗有WSSV感染抑制作用，可以免疫对虾，用来保护对虾免受对虾白斑综合征病毒的侵染。 

本发明的基因工程活疫苗的优点在于，所用酿酒酵母菌安全，培养方法简单易行，经济价廉，便于大规模生产，可用于对虾白斑综合征病毒口服疫苗。相对于其它疫苗，展示的VP28蛋白易被免疫系统识别，展示的VP28蛋白稳定性好。 

本发明的另一个目的是提供表面展示对虾白斑综合征病毒VP28重组酵母活疫苗在甲壳类养殖中的应用。 

本发明涉及编码VP28序列片段扩增的引物序列： 

28-s  GGCGGAATTCATGGATCTTTCTTTCACT 

28-a  TTCCTCGAGCTCGGTCTCAGTGCC 

本发明所采用的技术方案是： 

一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白VP28的重组酵母菌的制备方法，是利用酵母表面展示载体pYD1，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌EBY100，得到表面展示VP28的重组酵母菌。其特征在于含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP28基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP28。 

1.WSSV-VP28基因的制备： 

(1)WSSV病毒基因组的制备：将提纯的病毒置于0.2mg/ml蛋白酶K和1％月桂酰肌氨酸钠中，在65℃中静置2h。用氯仿和苯酚抽提后将得到的产物溶于50μl TE。-20℃保存，作为PCR扩增模板。 

(2)PCR扩增VP28基因：以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP28，凝胶电泳检测扩增PCR 产物大小，回收PCR产物。PCR反应条件：94℃变性5min，94℃40s，56℃40s，72℃40s，35个循环，72℃延伸5min。取2μlPCR产物作1％琼脂糖凝胶电泳。 

2.重组体的构建：