[发明专利]大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基及其培养方法

权利要求书

1.大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，包括MS培养基和愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，其特征在于：MS培养基按照以下原料制成：

a)大量元素(mg/L)：硝酸钾(KN03)1900、硝酸铵(NH4NO3)1650、磷酸二氢钾(KH2PO4)170、硫酸镁(MgSO4.7H2O)370、氯化钙(CaCl2.2H2O)440

b)微量元素(mg/L)：碘化钾(KI)0.83、硼酸(H3BO3)6.2、硫酸锰(MnSO4.4H2O)22.3、硫酸锌(ZnSO4.7 H2O)8.6、钼酸钠(Na2MoO4.2 H2O)0.25、硫酸铜(CuSO4.5 H2O)0.025、氯化钴(CoCl2)0.025

c)有机成分(mg/L)：肌醇100、甘氨酸2、盐酸硫胺素(VB1)0.1、盐酸吡哆醇(VB6)0.5、烟酸(VB5或VPP)0.5

d)铁盐(mg/L)：乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA)37.3、硫酸亚铁(FeSO24.7H2O)27.8。

2.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导与植株再生高效培养基配方，其特征在于按照以下成分组成：

a)主培养基：MS基本培养基+KT 2mg/L+IBA 0.4mg/L+2，4，5-T 2mg/L

b)A培养基(快速分化培养基)：MS基本培养基+KT 2.5mg/L+IAA0.5mg/L

c)B培养基(快速生根培养基)：MS基本培养基+IAA 0.25mg/L+IBA 0.4mg/L。

3.根据权利要求1所述的MS培养基，其特征在于：MS培养基要求PH 5.6-6.0，蔗糖30％，琼脂7g/L。

4.大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a)母液的配置：母液1(50×大量元素)

500ml母液称取：41.25g NH4NO3、47.5g KNO3、4.25g KH2PO4、9.25g MgSO4·7H2O

母液2(100×)250ml母液称取：11g CaCl2·2H2O

母液3：(棕色瓶)250ml母液(100×)695mg FeSO4·7H2O、932.5mg

Na2-EDTA

分别溶解，每个试剂溶于120ml水，用电炉或微波炉加热，再混合定容，

母液4(100×微量元素)，

250ml母液称取557.5mg MnSO4·4H2O、215mg ZnSO4·7H2O、205mgH3BO4、20.75mg KI、6.25mg Na2MoO4·2H2O、0.625mg CuSO4·5H2O、0.625mgCoCl2·6H2O

母液5(1000×)100ml母液称取：10mg硫胺酸B1、50mg吡哆醇B6、50mg烟酸、200mg甘氨酸

b)激素的配置：

1mg/ml 2，4，5-T：称取10mg 2，4，5-T于干燥的容器内，加入无水乙醇至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；

1mg/ml NAA或IAA：称取10mg NAA或IAA于干燥的容器内，逐滴加入无水乙醇，至完全溶解。用蒸馏水定容至10ml；

1mg/ml KT：称取10mg KT于干燥的容器内，逐滴加入1M的HCl.至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；

c)NaOH、HCl溶液的配置：

配置100ml 5N NaOH、4N HCl用于调节PH值：20g NaOH定容至100ml的蒸馏水中，34.48ml HCl定容至100ml的蒸馏水中；

d)MS溶液的混合

配制MS培养基时，每1000ml培养基取：20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml母液4、1ml母液5。分别依次加入到800ml蒸馏水中，混匀后加入30g蔗糖定溶至1000ml，用5N NaOH调PH到5.6-6.0；

e)添加激素

主培养基：每1000ml MS培养基中加入2ml KT(1mg/ml)+0.4ml IBA(1mg/ml)+2ml 2，4，5-T(1mg/ml)

A培养基：每1000ml MS培养基中加入2.5ml KT(1mg/ml)+0.5mlIAA(1mg/ml)

B培养基：每1000ml MS培养基中加入0.4ml IBA(1mg/ml)+0.25mlIAA(1mg/ml)

琼脂粉为0.8％，即每1000ml MS培养基中8g琼脂粉，加热溶解后分装至50ml三角瓶内；

f)高压灭菌：121度下灭菌15分钟，放置1-2天后备用；

g)外植体消毒：将竹种子洗净泡胀12小时，在超净台中用70％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗三次，0.1％升汞浸泡30min，期间不断震荡，再用无菌水冲洗5-6次；

h)愈伤组织诱导：取胚接种于愈伤组织培养基中，暗培养7-10天后转移至光照下。12h.d^-1光照条件下进行，光照强度2000lx，温度25-26℃。愈伤组织诱导同时可发生芽分化和植株再生。为加速芽分化，可将有芽点的愈伤转入快速分化培养基(A培养基)。该培养基也可以诱导无芽点的胚性愈伤组织分化成苗；

i)生根、壮苗与移栽：愈伤组织分化丛芽在B培养基上生根培养1-2周后，取出小苗在自来水下洗净根部的培养基，然后栽植到灭菌的介质中〔土∶蛭石∶泥炭土(质量比)＝1∶1∶1〕，遮荫散射光照射。