[发明专利]一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测食品质量的方法，具体的说，涉及一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

食品安全突发事件频率高是近年来社会公共安全问题的一个显著特点。在食品污染所引发的肠道疾病中，产肠毒素大肠杆菌是引起食物中毒的常见肠道致病菌之一。有效控制食品污染扩散，对食品质量的监督和检测提出了更高的要求。如何快速、准确的检测食品中的病原菌，是控制食品安全事故发生的基础。

目前，国内检测产肠毒素大肠杆菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间长，通常需要3～5天。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出10⁹靶序列拷贝，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。

本发明采用环媒恒温基因扩增技术，建立了快速检测不耐热型产肠毒素大肠杆菌的方法，缩短了检测时间(2-3小时完成)，提高了检测的灵敏性，为快速、准确检测食品是否发生病原菌污染，预防食品安全事故发生提供了可能。

发明内容

本发明提供一种检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒，其含有引物

SEQ ID NO：1  attacatttaagagcggcgc；

SEQ ID NO：2  ggttcctagcattagacatgcttt；

SEQ ID NO：3  gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；

SEQ ID NO：4  gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc

特异性扩增来自产肠毒素大肠杆菌的基因。

所述产肠毒素大肠杆菌的基因为编码不耐热肠毒素的基因，其基因序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步的，所述试剂盒还含有Mg²⁺，更进一步的，所述试剂盒还含有显色剂。

优选的，所述显色剂是绿色核酸凝胶染液(SYBR Green I)鉬酸铵或硫酸铜。

本发明的另一目的是提供一种快速检测食品是否被产肠毒素大肠杆菌污染的方法，包括以下步骤：

1)提取待检样本中的DNA；

2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物如SEQ ID NO：1～4所示；

3)对DNA扩增结果进行检测。

其中，步骤2)的扩增条件为，dNTPs浓度为0.6mM，Bst酶添加量为8U，扩增温度为55-65℃，扩增反应最短反应时间为40min。

步骤3)所述的检测DNA扩增结果的方法是：观察是否生成焦磷酸镁沉淀或沉淀显色。

根据本发明的另一方面，还提供如SEQ ID NO：1～4所示寡核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自病原体产肠毒素大肠杆菌的基因。

本发明依据不耐热肠毒素(LT)编码基因的6个保守区，采用引物设计软件设计LAMP引物，优化了dNTPs浓度、BstDNA聚合酶浓度、反应温度、反应时间等反应条件，结果理想，并对该方法进行了特异性、敏感性试验，初步探索了可实际应用的试剂盒条件。

产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)的核苷酸序列总长度约为70kb，主要有两类致病基因：一类为菌毛蛋白基因(或称粘着素、定居因子)，已知的粘着素有K₈₈，K₉₉，987P，CFA，PCF0166，F41等。另一类为肠毒素基因，ETEC的主要毒力因子为耐热性肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)和不耐热性肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)，ST和LT是导致幼龄动物腹泻的直接致病因子。ETEC借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上，从而大量繁殖，产生大量肠毒素。