[发明专利]一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备及其应用

权利要求书

1.一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于该疫苗包括流感五价或多价灭活疫苗抗原和黏膜免疫佐剂，混合比例为1∶1-10∶1(V/V)；

其中，流感五价或多价灭活疫苗抗原为全病毒、裂解病毒、病毒体或病毒样颗粒的灭活疫苗抗原，流感多价疫苗抗原为：流感五价，即H1N1、H3N2、B、H5N1和甲型H1N1，或在此基础上任意组合的多价疫苗抗原；或在此基础上包含了所述HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16，所述NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原；

其中，黏膜免疫佐剂为水包油型(MAF)佐剂、脑膜炎双球菌蛋白体佐剂、油/水乳剂型佐剂、水包油型佐剂、油包水型佐剂、颗粒型佐剂或微生物衍生物型佐剂。

2.如权利要求1所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于该疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1流感抗原，制备流感五价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，疫苗中抗原为通常所使用的量，HA抗原含量1.0-15.0μg/0.2ml/人份。

3.如权利要求1或2所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于取流感五价或多价灭活疫苗抗原和黏膜免疫佐剂，制成滴鼻剂型的液体、喷雾式的气溶胶、粉末状、乳脂状或乳化的病毒颗粒。

4.如权利要求1或2所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于其中疫苗黏膜免疫佐剂--脑膜炎双球菌蛋白体佐剂是重组PorA或重组PorB形式。

5.如权利要求1-4任一所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A.采用鸡胚培养或哺乳动物细胞培养获得流感五价或多价疫苗抗原；

B.经福尔马林或β-丙内酯灭活；

C.除菌、超滤浓缩；

D.采用柱层析或连续密度梯度超离心方法进行分离纯化，得流感五价或多价灭活疫苗原液；

E.流感五价或多价灭活疫苗半成品、成品配制：将流感五价或多价灭活疫苗原液配制成包括药学可接受的载体：标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，增溶剂；或配制成便于缓释的剂型；或添加黏膜疫苗佐剂制成流感五价或多价灭活疫苗。

6.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中A步骤包括以下步骤：

鸡胚培养获得流感五价或多价疫苗抗原：

将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感及其他亚型流感病毒株接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，33-35℃培养48-72h，4℃冰箱过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液获得大量病毒，病毒收获后通过滤器进行澄清过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原；

或哺乳动物细胞培养获得流感五价或多价疫苗抗原：

培养细胞：将用于疫苗生产的哺乳动物细胞系在15L转瓶内1∶6分种，培养2-3天后接种流感病毒疫苗株，包括季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感病毒疫苗株及其他亚型流感病毒疫苗株；或在发酵罐内使用微载体培养细胞；或在WAVE生物反应器中进行细胞培养；其中所述细胞由工作代细胞库复苏，经传代扩增得到；

接种病毒：在细胞密度达到3×10⁶/ml时以任何合适的感染复数接种病毒；

增殖病毒：接种病毒后，按照常规方式培养细胞，用于细胞生长的培养基为常规培养基，由合适的生产商购得，或按照已公开的配方配制合适的培养基，在含5％CO₂的培养箱中于34-35℃培养细胞48-72小时；

收获病毒：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒；

过滤：病毒收获后通过滤器进行澄清过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原。