[发明专利]一种结核分枝杆菌重组融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种结核分枝杆菌重组融合蛋白及其应用。

背景技术

结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)感染所致的人类疾病，是分支杆菌病的主要类型，主要通过呼吸道传播。自1882年德国科学家Rrobert Koch发现TB以来，全球约有两亿人死于TB，且疫情发展日趋严重。据WHO预计，全球现有TB病人2000万，如不控制今后10年还将有9000万人发病。我国现有3.3亿结核菌感染者，肺结核病人600多万，其中有严重传染性的病人150万，每年死于结核病的达25万人。因此，结核病的预防、早期诊断和及时治疗是高度关注的课题。MTB有H37RV与H37Ra两种标准菌株，前者为毒力株而后者为减毒突变株，它们均来源于1934年的人肺H37分离株。与一些临床分离株不同的是，H37RV对药物敏感、利于基因工程操作并在TB动物模型中保留了完整毒力，因而该菌株被广泛应用于TB相关的生物医药研究(MTb H37RV project at Sanger Institute，NCBI)。目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查(AFP)和培养法，以及分子生物学和血清学检查，这些方法多基于高特异性的抗原建立。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组融合蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

它来自结核分支杆菌H37RV。

本发明一种结核分枝杆菌重组融合蛋白，是由下述方法制的：

1)人工合成下述引物：

38-16-11a：ATCGCATATGTGTGGCTCGAAACCACCGAGC

38-16-11b：GATTGTTCATACCACCACCACCGCTGGAAATCGTCGCGATCGC

38-16-11c：GGTGGTGGTGGTATGAACAATCTCGCATTG

38-16-11d：TCCGCAATCACCACCACCACCCTACTTCGTATGGCGATGCG

38-16-11e：GGTGGTGGTGGTGATTGCGGATCCCATGAC

38-16-11f：ATCGCTCGAGTCCCAAGCTTCCTATGCGAA

以结核分支杆菌H37RV为模板进行扩增，制得基因38Kd-16Kd-11Kd；

2)将基因插入达载体pET-28b上，得重组质粒pET-28b-38Kd-16Kd-11Kd；

3)将重组质粒转染至大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化。

本发明另一个目的是提供一种结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测试剂盒，它包括：TB抗原和酶标二抗，其中TB抗原是上述的一种结核分枝杆菌重组融合蛋白，TB抗原包被量为1.0-8.0μg/孔，酶标二抗工作浓度为2.0-16.0mg/mL；

优选TB抗原包被量为2.0μg/孔，酶标二抗工作浓度为4.0mg/mL。

本发明另一个目的是提供一种结核分枝杆菌抗体IgG胶体金试剂盒，它包括：TB抗原、胶体金标记TB抗原和质控线包被兔抗TB抗体，其中TB抗原是上述的一种结核分枝杆菌重组融合蛋白；

TB抗原喷点浓度为0.25-2.0mg/mL，金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值50.0-100.0，TB抗原喷点量为0.5-1.75μL/cm，金标记TB抗原喷点量为0.5-1.75μL/cm，质控线抗TB抗体包被浓度为0.5-2.0mg/mL；反应膜封闭时间为45-75分钟，反应膜干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥30-75分钟，金标记抗原垫干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥3-5小时，标本检测反应时间为15℃～30℃下反应10-30分钟。

优选TB抗原喷点浓度为1.0mg/mL，金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值80.0，TB抗原喷点量为1.0μL/cm，金标记TB抗原喷点量为1.0μL/cm，质控线抗TB抗体包被浓度为1.0mg/mL；反应膜封闭时间为60分钟，反应膜干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥60分钟，金标记抗原垫干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥4小时，标本检测反应时间为15℃～30℃下反应25-30分钟，温度低于15℃时标本检测反应时间延长10分钟。