[发明专利]眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法。

背景技术

在基因治疗中，利用RNA干扰技术可特异性地阻断细胞内促新生血管生成基因转录，从而抑制眼内的新生血管。然而，基因治疗存在的一个问题是如何确保基因在体内高水平表达。裸露的外源基因难以进入细胞且容易被机体或细胞降解，难以高效、稳定地表达，仅能短暂地抑制新生血管生成过程，因此导致新生血管在眼内给药后复发。为了获得有效药物浓度，必须在较长的一段时期内反复给予玻璃体腔注射，这一有创性操作不可避免的导致某些眼部并发症发生，如玻璃体出血、视网膜脱离或眼内炎等。由于新生血管生长是一个较为长期的过程，采用玻璃体腔药物注射治疗眼部新生血管需要借助新型基因载体携带基因进入细胞，并持续释放表达产物来发挥其治疗作用。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，具有载药量大、大小分布均匀、可缓慢释放外源基因、减少反复玻璃体腔给药次数和眼部并发症发生的特点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分：

聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为95％～99％；

具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒的质量百分比为1％～5％，所说的具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒为缺氧诱导因子-1α短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1α或血管内皮生长因子短发卡式小干扰RNA质粒pshVEGF。

一种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，包括如下步骤：

首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒80μg～120μg溶于100μl～200μl三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲液作为内水相，在冰浴条件下将其滴加入1ml～2ml含有2％(重量比)可生物降解聚合物聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的二氯甲烷中，进行乳化形成油包水型初乳，同时高速搅拌30000转～40000转/分钟进行乳化60秒～90秒，形成油包水型初乳，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无分层；所说的具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒为缺氧诱导因子-1α短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1α或血管内皮生长因子短发卡式小干扰RNA质粒pshVEGF；

其次，将形成的油包水型初乳滴加入6ml～20ml的1％(w/v)的聚乙烯醇PVA外水相，油相∶外水相＝1∶6～1∶10，高速搅拌3分钟～5分钟，其转速为30000转/分钟～40000转/分钟，形成均匀的水包油包水型复乳；

最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在常压下搅拌3～4小时，挥发掉有机相，离心机的转速为13000转/分钟～15000转/分钟，离心时间为20分钟～25分钟，温度为3℃～4℃，离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA，制备成冻干粉，在温度3℃～4℃下保存。

本方法发明有益效果是，采用复乳一溶剂挥发法将具有干扰新生血管生成的质粒包被于可生物降解聚合物中形成载质粒纳米粒，实用有效、简便易行；由于载质粒纳米粒体积小，利于基因渗透入深层组织，到达靶细胞并被细胞吸收；通过选择聚合物分子量、亲水性的比率等理化特性，可延长包载的基因物质在细胞内的释放速率，从而延长基因的转染时间；同时纳米囊对基因的包裹或纳米颗粒表面长的侧链对吸附基因的遮蔽使包载在聚合物基质内的核酸片段免受核酸内切酶的作用；具备一定的细胞转染率；可通过表面修饰达到靶向化目的(为预测有益效果)；可生物降解聚合物在体内降解代谢为H₂O和CO₂，对活体组织无毒性，具有生物降解性、生物相容性。

附图说明

图1为本发明新型载pshHIF-1αPLGA纳米粒的粒径分布图。

图2为本方法发明新型载pshHIF-1αPLGA纳米粒的透射电镜图。

图3为本方法发明新型载pshHIF-1αPLGA纳米粒在体外的质粒释放-时间曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

一种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分：

聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为98.98％；

缺氧诱导因子-1α短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1α的质量百分比为1.02％。

一种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，采取复乳-溶剂挥发法，包括如下步骤：