[发明专利]用金属氧化物富集糖肽及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及糖肽和磷酸化肽的分离与纯化，具体地说是一种利用金属氧化物富集糖肽以及同时富集磷酸化肽和糖基化肽的方法。

技术背景

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中的研究热点课题，尤其是蛋白质的磷酸化和糖基化，是存在最为普遍，研究最为广泛的两种翻译后修饰过程。蛋白质的磷酸化几乎调控生命的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，也是目前所知道的信号的主要传递方式之一。同时，了解蛋白质的糖基化过程，对一些如癌症炎症等疾病的诊断和治疗都是具有非常重要的意义。目前，对于蛋白质翻译后修饰过程的研究一个非常重要的手段就是利用生物质谱解析蛋白质的肽段结构，但由于糖基化和磷酸化肽段离子化效率较低，质谱信号常常受到非修饰肽段的抑制，严重干扰对修饰肽段的检测。因此，在质谱分析前对磷酸化和糖基化肽段的富集是非常必要的[Liu，X.；Ma，L.；Li，J.J.Anal.Lett.2008，41，268；Morelle，W.；Canis，K.；Chirat，F.；Faid，V.；Michalski，J.C.Proteomics 2006，6，3993]。

近年来，很多富集糖肽的方法被提出和应用。最为常见的就是凝集素的方法，这种方法的选择性较好，但同时存在着通用性不强的缺点，尤其在处理复杂样品时很可能会丢失不能与凝集素特异性结合的糖肽[J.Glycoconjugate J.2004，21，35；Kubota，K.；Sato，Y.；Suzuki，Y.et al.Anal：Chem.2008，80，3693]；化学方法如肼化学可以选择性的富集糖肽，但是这种方法丢失糖链的信息[Zhang，H.；Li，X.J.；Martin，D.B.；Aebersold，R.Nat.Biotechnol.2003，21，660.]；亲水作用色谱也能够用来富集极性相对较大的糖肽，但是容易受到具有相当极性的非糖肽的干扰[Wada，Y.；Tajiri，M.；Yoshida，S.Anal.Chem.2004，76，6560.]；硼酸能与顺势二醇形成硼酸酯结构也可以用来绑定糖肽，但这种方法的费时较长[Zhou，W.；Yao，N.；Yao，G.P.；Deng，C.H.；Zhang，X.M.；Yang，P.Y.Chem.Commun.2008，5577.]；石墨化碳与极性的糖肽发生偶极相互作用而加强对糖肽的保留，但是不适用于具有较长肽段的糖肽。总之。目前还未见一种操作简单通用性强的富集方法来选择性的富集糖肽。用金属氧化物作为富集材料对糖肽进行富集目前未见报道。

相较于糖肽的富集磷酸化肽的富集近年来发展迅速，以氧化钛为代表的金属氧化物，在磷酸化肽富集方面展现了其选择性高特异性好的特点[Pinkse，M.W.H.；Uitto，P.M.；Hilhorst，M.J.；Ooms，B.；Heck，A.J.R.Anal.Chem.2004，76，3935；Larsen，M.R.；Thingholm，T.E.；Jensen，O.N.；Roepstorff，P.；Jorgensen，T.J.D.Mol.Cell.Proteomics 2005，4，873.]，已经被广泛的应用到磷酸化蛋白质组学中。但是，用金属氧化物在一次操作中同时得到糖肽和磷酸化肽还未见报道。

发明内容

为解决上述难点，发明人通过研究氧化钛微球对单糖和寡糖的色谱保留行为发现，糖在氧化钛色谱柱上有很强的保留，这种保留随糖链的增长而增强，随流动相酸性添加剂的浓度增加而减少。发明人将氧化钛微球的这个性质用于进行糖肽的富集，通过对结构明确的标准糖蛋白的酶解液在不同条件下洗脱糖肽和非糖肽，实现了对糖肽的选择性富集。同时，由于氧化钛可以同时保留糖肽和磷酸化肽，通过在酸性条件下洗脱糖肽，在碱性条件下洗脱磷酸化肽，实现了糖肽和磷酸化肽的同时富集。

用金属氧化物富集糖肽及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法，以金属氧化物作为固相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同时富集磷酸化肽和糖肽。

所述金属氧化物为氧化钛、氧化锆、氧化铝中的一种或多种复合金属氧化物；金属氧化物材料形态为纳米材料、微球材料以及金属氧化物涂覆或包覆的球形或无定形材料。

所述富集的过程为柱萃取，具体操作如下：

1)将金属氧化物装入萃取柱管中，将pH为5-8蛋白酶解物上样到萃取柱中，蛋白酶解物与金属氧化物材料的重量比例为1∶1～200；

2)分别用1～10倍柱体积的盐溶液、1～10倍柱体积的含有有机酸的乙腈水溶液冲洗萃取柱，乙腈的体积浓度为0-95％；