[发明专利]使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法

说明书

技术领域

一种使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法。

背景技术

己烯雌酚属激素类药物，添加在饲料中，有促进鱼类等养殖活体生长的作 用，目前在水产养殖上有广泛的使用。

己烯雌酚作为一种人工合成的化学物质，具有较强的类雌激素作用。经科 学实验确证，己烯雌酚是一种致癌物质，长期食用，会对人和动物的健康造成 危害，甚至致癌，乃至威胁生命。世界多数国家已经禁止在饲料中使用己烯雌 酚。我国农业部第193号公告规定，截止2002年5月15日，己烯雌酚及其盐、 酯制剂停止在所有食品动物中使用。

为了满足检测所有食品动物中是否含有己烯雌酚成分，需要有切实可行的 检测方法。

以前，己烯雌酚残留的检测方法有ELLISA法、HPLC紫外法、GC-MS法、 LC-MS/MS法。HPLC紫外法的测限为0.25mg/kg。ELLISA法虽然测限比较低， 但因其操作方法复杂和过为专业，只适合作为一种筛选方法使用。GC-MS法和 LC-MS/MS法成本昂贵，无法在生产中普及使用。

目前，尚没有成本低廉、测限又可以满足使用需求的DES(己烯雌酚)残 留检测方法，不能满足社会进步和市场日益繁荣的需求。

发明内容

本发明设计一种使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方 法，通过对己烯雌酚进行磺化水解处理，使其生成发有荧光的反应物，然后用 高效液相色谱荧光检测器对其进行分析，从而得到能够与LC-MS/MS法相媲美 的灵敏度和回收率，适合水产品中己烯雌酚残留量的测定。

本发明成本低廉、方法简洁、测限可以满足使用需求，适合在生产实践中 推广使用。

本发明使用的仪器如下：

Waters2695高效液相色谱仪，配2475荧光检测器、高速离心机(LG-10A)、 超声波清洗器、氮吹仪、旋转蒸发仪、真空装置和机械泵或ASPEC XL4自动固 相萃取系统、SLH柱、SPE装置、正相固相萃取小柱(SLH)。

本发明使用的试剂如下：

己烯雌酚标准品(99.5％，美国SIGMA-ALDRICH公司)、硫酸(分析纯)、 溴化十六烷基三甲铵(分析纯)、甲酸(色谱纯)、乙酸乙酯(色谱纯)、甲醇(色 谱纯)。

本发明的色谱条件如下：

色谱柱：Sunfire C184.6mm×150mm，5μm；流动相：A为甲醇，B为2mmol/L 溴化十六烷基三甲铵；A∶B＝40∶60；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；激发波 长：发射波长：进样量：20μL。

本发明的方法如下：

一种使用液相色谱荧光法测定水产品中己烯雌酚残留量的方法，其特征在 于：

(1)称取10g绞碎的水产品样品于50mL塑料离心管中，加入乙酸乙酯20 mL，均质30s，7000r/min离心10min，移取乙酸乙酯层于100mL梨形瓶中， 残渣再加入10mL乙酸乙酯，重复提取一次，离心后合并乙酸乙酯层，于40-50℃ 旋转蒸发至含水量至干，用2mL体积比为85∶15正己烷∶乙酸乙酯剂溶解残留 物，搅拌6min；

(2)用5mL正己烷、5mL乙酸乙酯活化SLH柱，将提取液加到SLH柱上， 并控制流速为2mL/min；用2mL正己烷，2mL体积比为85∶15的正己烷∶乙 酸乙酯混合溶液淋洗SLH柱，用10mL体积比为82∶20的正己烷∶乙酸乙酯混 合溶液洗脱，流速控制为2mL/min，收集洗脱液，50℃水浴氮气吹干至初始状 态；

(3)在氮气吹干的离心管中加入1mL硫酸，漩涡混合0.5min，放置90min， 在离心管中加入8mL水，漩涡混合漩涡混合0.5min，放置30min，加入5mL 乙酸乙酯提取液，提取液50℃水浴氮气吹干，用1mL流动相定容，供高效液相 色谱测定即可。

使用本发明时，配制浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，50.0，100.0μg/L的己烯 雌酚标准溶液，按本发明工艺步骤和仪器条件，可得到己烯雌酚浓度(Y)与峰 面积(X)之间的线性关系，相关系数r大于0.99。按信噪比大于3计算，水产 品中的己烯雌酚的检出限可达到0.1μg/kg。

本发明成本低廉、方法简洁、测限低，适合在生产实践中推广使用，是市 场中需要的技术手段，有积极的社会意义和社会需求。

具体实施方式