[发明专利]兔三联灭活疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种兔三联灭活疫苗，其特征在于：主要由灭活脱毒后的兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的体积比所组成。

2.按照权利要求1所述的兔三联灭活疫苗，其特征在于：每只份疫苗中含A型产气荚膜梭菌数不低于2×10⁷CFU/ml；每只份疫苗中含兔多杀性巴氏杆菌数不低于5.0×10⁹CFU/ml。

3.按照权利要求1所述的兔三联灭活疫苗，其特征在于：所述的灭活脱毒后的兔病毒性出血症病毒液是将所制备的兔病毒性出血症病毒原液稀释50倍后所得到的稀释液。

4.一种制备权利要求1-3任何一项所述兔三联灭活疫苗的方法，包括：

(1)分别制备兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液；将兔病毒性出血症病毒液灭活脱毒后的原液稀释50倍，备用；将兔多杀性巴氏杆菌苗菌液灭活脱毒后的原液浓缩2倍，备用；将兔A型产气荚膜梭菌苗菌液灭活脱毒后的原液浓缩4倍，备用；

(2)将上述步骤所制备的兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的体积进行配苗，加入硫柳汞至混合物总体积的0.005％，充分混匀，即得。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述兔病毒性出血症病毒液按照以下方法制备得到：

一、生产用毒种制备

将兔病毒性出血症病毒毒种稀释后接种健康易感的家兔；无菌采集接种后濒死或刚死亡且有典型病理变化家兔的肝、脾经检验合格后，保存作为生产用毒种备用；

二、制苗用病毒液的制备

取生产用毒种稀释，每只家兔皮下注射；接种后24-96h内濒死或刚死亡家兔，无菌采取肝、脾、肾、心、肺作为制苗材料；无菌剔除各脏器的脂肪与结缔组织，称重，加磷酸盐缓冲液或生理盐水进行捣碎或研磨，过滤，离心取上清液，即得。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述兔多杀性巴氏杆菌苗菌液按照以下方法制备得到：

一、生产用种子制备

1、一级种子繁殖

(1)取A型多杀性巴氏杆菌菌株冻干菌种接种含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤，置36-37℃培养18-24h；

(2)取样划线接种含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板，选取典型菌落，接种鲜血琼脂斜面，置36～37℃培养18-24h，作为一级种子备用；

二、二级种子繁殖

取一级种子接种含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，置36-37℃培养18～24h，经纯粹检验合格后，置2-8℃保存，备用；

三、制苗用菌液的制备

用培养罐或玻璃瓶通气培养，按培养容器容积装入培养基及消泡剂，灭菌后按培养基总量的3-5％接种二级种子液，并加入0.1％裂解血球全血，采用逐渐增大通气量的方法，于36-37℃通气培养12-16h，即得。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：在一级种子繁殖的步骤(1)中按培养基总重量的3％-7％的接种量，将兔A型多杀性巴氏杆菌菌株接种于含0.1％裂解全血的改良马丁肉汤中，于37℃通气培养10-24h；优选的，按培养基总重量的5％的接种量，将兔A型多杀性巴氏杆菌菌株接种于含0.1％裂解全血的改良马丁肉汤中，于37℃通气培养12-16h。

8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的兔A型产气荚膜梭菌菌液按照以下方法制备得到：

一、生产用种子制备

1、一级种子繁殖

(1)取兔A型产气荚膜梭菌菌株冻干菌种接种肉肝胃酶或胃膜消化汤，置36-37℃培养18-20h；

(2)取样接种于普通琼脂斜面、普通肉汤、厌气肉肝汤或石蕊牛奶，培养，作为一级种子备用；

二、二级种子繁殖

取一级种子接种肉肝胃酶或胃膜消化汤，置36-37℃培养，置2-8℃保存；

三、制苗用菌液的制备

按培养基总体积的1％加入10％硫乙醇酸钠溶液，并按总体积的5％加入7.5％碳酸氢钠溶液，调pH至7.8-8.0；再按培养基总体积的2％-3％接入二级种子，置36-37℃培养，即得。