[发明专利]一种生物分子竞争分析方法及其应用

说明书

(一)技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种生物分子竞争分析方法及其应用。

(二)背景技术：

1971年用酶代替同位素制备了酶标记试剂，建立了酶联免疫分析方法(ELISA)。该方法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于实现自动化操作等特点，现已广泛应用于临床诊断、生化分析、食品安全、环境监测等各生物检测领域，原则上适用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可直接定量测定体液中的可溶性抗原。其基本模式是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将固相上的抗原-抗体合物与液相中的游离成分分开。

ELISA常用的方法主要包括双抗体夹心法、间接法、竞争法：(1)双抗体夹心法，是检测抗原最常用的方法，利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性，检测灵敏度可提高到pg级的水平，适用于测定2价或2价以上的大分子抗原，但不适用于测定不能形成两位点夹心的半抗原及小分子单价抗原。(2)间接法，是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体，这种方法操作简单，只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法，其成功的关键在于抗原的纯度以及正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体，因此常因高背景而特异性较差，目前已逐渐被夹心法取代。(3)竞争法，可用于测定抗原，也可用于测定抗体；当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体，其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原的结合，如抗原为高纯度的，可直接包被于固相，如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原，洗涤除去抗原中的杂质，然后再加入标本和酶标抗体进行竞争结合反应；小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夹心法的两个以上的位点而不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式，其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。用抗原包被来与液相抗原间接竞争的方法是一种低灵敏度的方法，而包被抗体，目标抗原与标记抗原竞争的方法能显著提高灵敏度。

对于小分子抗原来说，由于其抗体是联接载体蛋白免疫得到的，产生的抗体除了针对抗原的，还有针对载体蛋白与抗原-载体联接部位的，即便是针对抗原，也有可能因为载体蛋白的导向作用使其对偶联蛋白比游离小分子具有更高的亲和力。在进行检测时，一般会使用偶联蛋白进行包被或小分子标记HRP，所以会有抗体对固相抗原或标记抗原的亲和力强，而加入抗原后的抑制作用弱。如果检测系统使用的偶联物的偶联位点改变一下，就会出现效价下降的现象。所以需要筛选合适的，对偶联物及小分子亲和力一致的单抗用于检测，并需要从抗体质量及抗原抗体比例等多方面进行探索，可见小分子抗原的ELISA方法建立并不容易实现。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种生物分子竞争分析方法及其应用，其检测方法建立周期短、灵敏度高、特异性强，适用于生物检测中靶标的分析，尤其适用于小分子抗原或半抗原的测定。

本发明的技术方案：一种生物分子竞争分析方法，其特征在于它为利用核酸适体作为亲和配体，与标记的靶标一起建立的竞争分析方法，包括以下步骤：

(1)靶标核酸适体包被；

(2)与标记的靶标分子孵育结合；

(3)加入靶标样品竞争分析；

(4)洗涤后，加入底物进行分析。

上述所说的步骤(1)中的核酸适体包被是由核酸适体通过直接或间接的方式以共价键或非共价键形式包被在固相基质上。

上述所说的步骤(1)中的核酸适体既能与标记的靶标结合，也能与靶标结合，但其与靶标结合的能力高于与标记靶标结合的能力，靶标可竞争标记靶标结合核酸适体。

上述所说的核酸适体为单链DNA即ssDNA或RNA。

上述所说的核酸适体是通过指数富集配体进化系统即SELEX技术体外筛选获得的与靶标有特异结合的核酸序列。

上述所说的核酸适体的筛选包括以下步骤：

①合成制备ssDNA或RNA文库；

②以标记的靶标作为筛选分子，富集与其特异亲和的核酸序列；

③用靶标竞争洗脱，获得靶标特异的多克隆核酸适体，制备次级文库；

④筛选数轮，克隆测序，获得靶标的单克隆核酸适体。

上述所说的靶标是生物检测中靶标，包括生物大分子或生物小分子。