[发明专利]一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法

权利要求书

1.一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于：

A、捕获探针DNA₁的固定

先将玻片醛基化，再将碱基序列为5’-CAC TTT TTC TTA AAT GTT GTT CTTTTTTTTTT-3’-NH₂的捕获探针DNA₁稀释到1×10^-7mol/L，取40μL DNA₁滴加到己醛基化的玻片表面，室温反应3h；最后洗涤并封闭剩余的醛基；

B、稀土铕配合物标记识别探针DNA₂

(1)将2mg稀土铕配合物Eu(TTA)₃phen分散到5mL 2.5％戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的Eu(TTA)₃phen颗粒重新悬于4mL pH为7.2的PBS溶液中备用；

(2)再将碱基序列为NH₂-5’-TTTTTTTTTT ATT TTC TCT TTT TTC GCT T-3’的识别探针DNA₂配成使用浓度15μg/mL，将识别探针DNA₂加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中，30℃下于震荡培养箱中反应5h，反应完成后离心洗涤；再分散于2mLPBS缓冲液中备用；

C、金黄色葡萄球菌DNA提取

D、杂交

(1)杂交反应前，将提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA通过高温解链使其变性成为单链；

(2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA₂与提取的待测单链DNA在固定了DNA₁的玻璃片上杂交9h。杂交体系中的组分为10μL提取的单链DNA，10μL标记了稀土铕配合物的DNA₂和10μL 12×SSC溶液；保持杂交温度为53℃；

(3)杂交后，将玻片依次在以下3种洗涤液中清洗，洗涤液I(1×SSC/0.03％SDS)、洗液II(0.2×SSC)和洗液III(0.05×SSC)，总洗涤时间为4.5分钟，每次1.5分钟，洗涤温度为53℃；

E、杂交后信号检测

杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA₂、捕获DNA₁和目标DNA探针形成的杂交体，在激发和发射狭缝均为8.0nm，延迟时间0.1ms，门时间1.0ms；激发波长为368nm的检测条件下产生一个发射波长为612nm光信号，检测出玻片上的稀土长寿命发光配合物的光信号，从而根据检测的光信号检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌DNA。