[发明专利]一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种基于双探针串联DNA杂交模型与时间分辨荧光法结合的检测金黄色葡萄菌的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水体、灰尘及人和动物的排泄物中都可以找到。金黄色葡萄球菌是一种重要的致病微生物，它能产生较多的毒素和酶等毒力因子，且毒力强，由金黄色葡萄球菌感染可引起多种疾病，包括食物中毒、假膜性肠炎、烫伤皮肤综合症、毒素休克综合症、化脓性炎症和败血症等，给人类造成了极大的威胁和损失，引起了人们的广泛关注。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性的卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大达45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。

目前，金黄色葡萄球菌的检测方法大致包括传统的细菌培养方法及生化鉴定、免疫学方法、荧光定量PCR法、荧光原位杂交法(FISH，Fluorescent in situ hybridization)以及基因芯片法等，这些检测方法均有各自的优势但同时也存在不同层次上的不足，比如FISH法能够直接运用到复杂样品的检测中，且无需提取样品的DNA，直接保留了样品DNA的完整性；但样品中某些菌体本身的自体荧光、荧光探针信号的衰减、固定的微生物细胞过少等因素均可能导致实验产生假阴性结果；基因芯片法是近年来迅速发展起来的核酸检测技术，其快速、方便简单等优势成为该技术的亮点，但由于该技术需要昂贵的先进检测设备和运行成本，使其难以推广应用。

将具有长寿命发光性能的荧光物质与生物探针技术相结合，利用时间分辨的方法可有效消除样品中荧光背景和固定基质背景光的干扰，能够有效提高检测的灵敏度。本发明采用本团队研究合成的长寿命荧光稀土铕配合物Eu(TTA)₃phen作为标识DNA探针的荧光物质，将两条双功能探针串联与目标特异性DNA片段形成杂交体系的检测技术，初步建立了对金黄色葡萄球菌检测的一种通用性好、高灵敏度和精确度的检验方法及其检测条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法。该检测方法用时短，反应结果直观、灵敏、准确。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：

A、捕获探针DNA₁的固定

先将玻片醛基化，再将碱基序列：5’-CAC TTT TTC TTA AAT GTT GTT CTTTTTTTTTT-3’-NH₂的捕获探针DNA₁稀释到1×10^-7mol/L，取40μL DNA₁滴加到己醛基化的玻片表面，室温反应3h；最后洗涤并封闭剩余的醛基；

B、稀土铕配合物标记识别探针DNA₂

(1)将2mg稀土铕配合物Eu(TTA)₃phen分散到5mL 2.5％戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的Eu(TTA)₃phen颗粒重新悬于4mL pH为7.2的PBS溶液中备用；

(2)再将碱基序列为NH₂-5’-TTTTTTTTTT ATT TTC TCT TTT TTC GCT T-3’的识别探针DNA₂配成使用浓度15μg/mL，识别探针DNA₂加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中，30℃下于震荡培养箱中反应5h，反应完成后离心洗涤；再分散于2mLPBS缓冲液中备用。

C、金黄色葡萄球菌DNA提取

D、杂交

(1)杂交反应前，将提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA通过高温解链使其变性成为单链；

(2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA₂与提取的待测单链DNA在固定了DNA₁的玻璃片上杂交9h。杂交体系中的组分为10μL提取的单链DNA，10μL标记了稀土铕配合物的DNA₂，10μL 12×SSC溶液；保持杂交温度为53℃；

(3)杂交后，将玻片依次在以下3种洗涤液中清洗，洗涤液I(1×SSC/0.03％SDS)、洗液II(0.2×SSC)和洗液III(0.05×SSC)，总洗涤时间为4.5分钟，每次1.5分钟，洗涤温度为53℃；