[发明专利]一株大量产生γ-聚谷氨酸的诱变菌株地衣芽孢杆菌TKPG091

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株大量产生γ-聚谷氨酸的诱变菌株地衣芽孢杆菌TKPG091及其培养方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸[γ-poly(glutamic acid)，γ-PGA]，是由L-谷氨酸[L-Glu]、D-谷氨酸[D-Glu]通过γ-酰胺键结合形成的一种高分子氨基酸聚合物。该种材料降解的产物无毒无害，不会对环境产生二次污染，近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。γ-聚谷氨酸作为一种高分子聚合物，具有一些独特的物理、化学和生物学特性，如生物可降解性、良好生物相容性、强保水性、对人体无毒害等特性。这些特性决定了γ-聚谷氨酸在农业、食品、医药、环保、化妆品工业、烟草、皮革制造工业和植物种子保护等领域的广泛用途。

γ-聚谷氨酸是迄今发现的少数几个可以利用生物聚合得到得聚谷氨酸之一。PGA在1937年首次在炭疽芽孢杆菌的芽孢中被发现(novics and Bruckner1937；novics ands 1937)。1942年Bovamick等人发现有些芽孢杆菌属细菌能通过发酵培养积累聚谷氨酸，许多研究就此代谢产物而开展。1973年Troy发现γ-聚谷氨酸(以下简称γ-PGA)是Bacillus anthracis细胞夹膜的一种化学组分，它是一种水溶性的酰胺化合物，可以通过芽抱杆菌的变种来生产。目前日本、韩国和美国等一些过年对γ-PGA发酵的研究处于世界领先水平，很多相关的生产工艺和技术已形成专利。其中，日本明治制果公司已实现了γ-PGA商业化生产，并逐步推广其应用。近年来，国外已经开始利用分子生物学和代谢工程的理论和技术进行γ-PGA合成相关基因和相关合成酶的研究。到目前为止，生物合成γ-PGA的详细机制还不是很清楚。尽管如此国内对发酵生产γ-PGA的研究起步较晚，虽然最近的几年内取得了很大的进展，但较国外的研究水平还有很大的差距。因此加强γ-聚谷氨酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究平台，具有重要的理论价值和应用价值。

目前合成γ-PGA的主要方法是化学合成法、提取法和微生物液态发酵法等。化学合成法应用于PGA的合成，面临的主要问题是工艺路线较长，副产物多，收率低。由于PGA作为一种高分子聚合物，其许多物理化学性质与分子量密切相关，采用化学合成法得到的PGA分子量较低，而提高产物分子量必将大大降低产率，因此，该方法不具备实际应用价值。提取法由于本产品固有的特性，使得提取工艺复杂，成本较高，无法大规模生产。γ-PGA的制备方法主要集中在微生物发酵合成，生物合成γ-PGA具有突出的优点，分子量高、生产条件温和、产物纯度较高，但微生物发酵生产γ-PGA产量不高，而且极高的生产成本未能实现大规模的工业生产，以致影响了该物质的应用。

本发明利用复合诱变技术筛选获得一株γ-聚谷氨酸高产菌株TKPG091(Bacillus licheniformis，该菌株于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3336；分类命名：地衣芽孢杆菌；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，提高γ-聚谷氨酸的产量，有效降低了生产成本，实现了γ-聚谷氨酸的工业化生产。

发明内容

本发明利用复合诱变技术筛选获得一株γ-聚谷氨酸高产菌株——地衣芽孢杆菌TKPG091(Bacillus licheniformis，该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3336)，该菌株是以从原产我国四川省的豆豉中筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007为出发菌株经紫外线诱变后得到的，本发明解决该技术问题所采用的技术方案为：

1.采用多组复合诱变技术选育γ-聚谷氨酸高产菌株

(1)选择生长良好的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做10⁶个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，将菌悬液梯度稀释涂平板，避光培养，计算致死率；

(2)根据(1)致死率选择高、中、低三个不同剂量的照射时间分别对菌株NXTK0007的孢子悬浮液进行紫外照射处理；

(3)然后把(2)三个不同照射时间的菌悬液混合均匀，梯度稀释涂平板，避光培养；