[发明专利]一种利用核苷酸变化检测辐射处理农产品和畜禽肉的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及辐射处理农产品和食品的检测方法，属于食品安全领域。

背景技术：

辐射处理技术作为一种食品保鲜技术已被全世界广泛采用，目前已有49个国家至少核准了一类或一种辐射食品，35个国家已将此技术用于商业用途。食品辐射技术是运用X射线、γ射线或电子高速射线辐射食品，使食品中产生物理或化学反应，抑制或破坏其新陈代谢和生长发育，甚至使细胞组织死亡，从而达到消毒灭菌、延长食品储藏销售时间、减少损失的目的。虽然有越来越多的国家和消费者对辐射食品持认可态度，但是仍有一些国家拒绝辐射食品，这些国家对进口辐射食品的限制甚严。因此为了达到国际贸易的相互监督、检查，以利于严格管理和有效控制，辐射食品检测方法的研究也在不断加强。

目前热释光法、ESR法以及化学法等一再国际贸易中被使用。由于这些方法均需要使用昂贵的仪器，方法复杂、对操作人员要求也比较高，因此需要开发适合大量样品检测的快速初筛检测方法。

通过检测核苷酸变化的方法能够满足快速检测辐射食品的要求。最简单的检测DNA的方法是过滤法。Flegeau等人用过滤法研究了冷冻的挪威龙虾肉中DNA分子大小的变化，他们用2μm孔径的滤器将DNA截留在滤器上，用显微荧光测定法测量截留的DNA的量，他们发现，用3kGy计量辐射的龙虾肉保留的DNA量为0.21μg，比未辐射中的2.32μg少得多。

发明内容

本发明针对食品安全中辐射食品检测种类繁多，检测通量要求高的特点，为解决当前辐射食品检测中存在的价格昂贵、操作费时、检测通量低等缺陷，提供一种利用核苷酸变化检测辐射食品的方法，具体来讲是通过检测辐射食品中核苷酸的变化来判断该食品是否是经过辐射处理的食品的方法。

DNA片段可由多种物理或化学方法处理得到，如离子辐射。将含有DNA的食品进行离子辐射处理，则DNA的一条单链或者双链断裂而产生不同的DNA片段。这些片段可用单细胞或者单细胞核凝胶电泳来检测。将样品用琼脂糖固定在显微镜载玻片上后，用去垢剂裂解细胞以破坏细胞膜，然后在设定的电压下进行电泳。各DNA片段从细胞内向阳极方向延伸或迁移，就如同向着阳极方向形成一条尾巴。由于细胞核中的超螺旋DNA的解体，使得单链裂解对电泳图形形状也产生一定的影响。受到辐射的细胞其DNA(更多片段)从细胞核到阳极的图形比未受到辐射的细胞更长一些。未受到辐射的细胞其图形近似于圆形或只有很短的尾巴。

利用核苷酸变化检测辐射农产品和畜禽肉的方法包括：细胞的分离、毛玻璃的处理、细胞的包埋、细胞的裂解、核苷酸的分离以及显微荧光检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1.细胞的分离：对于鸡肉、猪肝样品等畜肉、禽肉或水产品样品可用解剖刀将切成极薄的薄片，取1g样品转移至盛有2mL冰冷Hanks溶液的小烧杯中。用剪刀将小薄片剪碎。对于胡椒、辣椒等植物样品可通过质量浓度为0.25％胰酶、质量浓度为0.1％的I型胶原酶(Sigma)1∶1混合消化液消化20min，血清中和。悬浮液通过孔径大小200μm的筛布进行过滤。滤液放置于冰上，用Hanks液调整细胞浓度10⁷-10⁸/mL置冰浴中待用。

2.铺胶：将将100μL细胞悬浮液与约1mL低熔点凝胶溶液(质量分数为0.625％)混合。将载玻片置冰上5分钟，取100μL混合物转移至已预涂层的载玻片上，用解剖刀尖将盖玻片移至一侧，轻轻盖在琼脂糖上。确保凝胶均匀、无气泡。凝胶凝固后将盖玻片揭掉。可以使用相同的凝胶液同时制备几块载玻片。

3.裂解细胞：将固定凝胶之后的载玻片完全浸入裂解缓冲液(2.5mol/L NaCl、100mMNa₂EDTA、质量分数为0.1％N-月桂肌氨酸钠、10mMTris-HCl、0.1％Triton X-100和体积分数为10％DMSO)中，室温下，浸泡1.5-2小时。不要碰琼脂糖层。裂解细胞后，将载玻片浸入电泳缓冲液中5分钟。

4.电泳：将载玻片一个挨一个放在水平电泳槽中，避免留有空间，并使其磨砂面正对阴极。加入新配置电泳缓冲液(1M Tris-HCl pH7.2)至高出载玻片2-4mm(不要让载玻片发生漂移)。室温，2V/cm(电压/电极间距离)电泳20分钟。小心取出载玻片，在水中浸泡5分钟，无水乙醇脱水10分钟。

5.染色：将载玻片浸入溴化乙锭染液(2mg/L)中3-5分钟。浸泡在水中1-2分钟清洗载玻片。在用荧光显微镜观察前，准备好盖玻片盖在载玻片的湿面上，沾掉多余水分。立即观察，因干燥后会影响细胞观察效果。