[发明专利]一种快速分离厌氧微藻的方法

权利要求书

1.一种快速分离厌氧微藻的方法，其特征在于：将待分离样品加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品1ml，稀释至10^-5，10^-6和10^-7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5％琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1.5％琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养5-10天；

若上述培养基中出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中存在厌氧微藻；若上述培养基中没有出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中不存在厌氧微藻；

所述样品为绿藻门GXNN01；

所述培养基中出现蓝色或绿色藻落，将培养基上固体石蜡去掉，用巴氏吸管将蓝色或绿色藻落吸出至TAP液体培养基中培养，待颜色变绿后，将藻落加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品1ml，稀释至10^-5，10^-6和10^-7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5％琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1.5％琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养5-10天，为一个周期，如此重复3至4个周期；即获得纯化后藻液；

所述纯化后藻液接种于TAP培养基中，加入终浓度为1mg/L的刃天青作为厌氧指示剂，另外加入终浓度为0.1％(m/m)的连二亚硫酸钠作为除氧剂，而后将其处于厌氧状态，置于光照培养箱中培养至培养基变为蓝色或绿色，取藻落加入连二亚硫酸钠，若蓝色或绿色不褪去，表明分离到的微藻已经生长，属于厌氧微藻；

所述涂布有待分离样品的加入1.5％琼脂的TAP培养基，于121℃灭菌20min，冷却后涂布；再涂布有待分离样品的加入1.5％琼脂的TAP培养基上再铺的加入1.5％琼脂的TAP培养基于121℃灭菌20min，冷却至45℃，待用；所述低熔点固体石蜡为60℃石蜡。

2.按权利要求1所述的快速分离厌氧微藻的方法，其特征在于：所述厌氧状态为将培养基密封后迅速充入高纯氮气一分钟，刃天青由蓝色变为无色，即为厌氧状态。