[发明专利]一种快速分离厌氧微藻的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微藻的分离方法，具体的说是一种快速分离厌氧微藻的方法。

背景技术

微藻是一种生物制氢的重要材料，在其生产氢气的过程中必须给予一个严格的厌氧环境，防止氢气与氧气结合。蓝藻细胞主要依靠固氮酶释放氢气，只要去除铵离子，氮气等底物以及氧气，就可以在厌氧环境下持续产氢。对于绿藻，目前常用的技术方法是“间接生物光解”法，首先正常培养绿藻细胞，使之靠光合作用累积自身所需的碳水化合物；然后将收获的绿藻细胞培养在缺硫的培养基中，此后PSII活性很快丧失，而线粒体的呼吸作用几乎不受影响，导致培养基中的O₂逐渐被呼吸作用消耗掉，氢酶活性达到最大，从而得到了较高的产氢量。一段时间后再将第二阶段的细胞转移到正常培养基中，重新进“第一阶段”，如此周而复始。然而，不管是蓝藻的固氮酶还是绿藻的氢酶，它们对氧气都是极其敏感的，氧气的发生会极大地限制氢气产量。但是严格的厌氧环境反过来又会抑制微藻细胞的生长，使得操作技术复杂化。如果能够找到在厌氧环境下快速生长的微藻藻种，那么不仅可以大大减少操作技术的复杂性，而且也能获得较高的氢气产量。随着微藻作为生物制氢的材料越来越受到重视，分离培养这种具有厌氧生长能力的微藻藻种具有重要的潜在应用价值。

厌氧微藻作为一类特殊的生物群体，反应了生物从无氧环境到有氧环境的生物进化历程，因此是生命进化树上的重要一环，具有重要的研究价值。

厌氧微生物的分离培养已有许多成熟的技术，比如亨盖特滚管技术，厌氧培养箱操作技术等等，但是这些方法操作复杂，成本高昂，不适合于快速地分离鉴定厌氧微藻。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速分离厌氧微藻的方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种快速分离厌氧微藻的方法：将待分离样品加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品1ml，稀释至10^-5，10^-6和10^-7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5％琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1.5％琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养5-10天；

若上述培养基中出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中存在厌氧微藻；若上述培养基中没有出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中不存在厌氧微藻。

所述培养基中出现蓝色或绿色藻落，将培养基上固体石蜡去掉，用巴氏吸管将蓝色或绿色藻落吸出至TAP液体培养基中培养，待颜色变绿后，将藻落加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品1ml，稀释至10^-5，10^-6和10^-7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5％琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1.5％琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m^-2·s^-1条件下培养5-10天，为一个周期，如此重复3至4个周期；即获得纯化后藻液。

所述纯化后藻液接种于TAP培养基中，加入终浓度为1mg/L的刃天青作为厌氧指示剂，另外加入终浓度为0.1％(m/m)的连二亚硫酸钠作为除氧剂，而后将其处于厌氧状态，置于光照培养箱中培养至培养基变为蓝色或绿色，取藻落加入连二亚硫酸钠，若蓝色或绿色不褪去，表明分离到的微藻已经生长，属于厌氧微藻。

所述厌氧状态为将培养基密封后迅速充入高纯氮气一分钟，刃天青由蓝色变为无色，即为厌氧状态。

所述涂布有待分离样品的加入1.5％琼脂的TAP培养基，于121℃灭菌20min，冷却后涂布；再涂布有待分离样品的加入1.5％琼脂的TAP培养基上再铺的加入1.5％琼脂的TAP培养基于121℃灭菌20min，冷却至45℃，待用；所述低熔点固体石蜡为60℃石蜡。