[发明专利]一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶的制备方法

权利要求书

1.一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶，简称电泳纯苋菜13-HPL，的 制备方法，其特征在于步骤为：苋菜13-HPL冻干微粒体酶的制备、初步纯化、 电泳纯纯化；

(1)制备苋菜13-HPL冻干微粒体酶：以苋菜为原料，清洗并除去其中的 泥沙及其它杂物，摘除根部和茎，沥干水分，将苋菜叶切成小片，苋菜叶与在0～ 10℃预冷的0.5～5倍体积/苋菜叶重量(v/w)的缓冲液A混合、且在组织捣碎 机中均浆10s-300s，经四层纱布过滤；

将纱布过滤液在0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀溶于10～ 50倍体积/沉淀重量(v/w)的缓冲液B，分装，冷冻干燥36～108h得冻干苋菜 13-HPL微粒体酶；

(2)初步纯化：冻干苋菜13-HPL微粒体酶经洗涤，溶解，硫酸铵沉淀， 透析，微滤获得初步纯化苋菜13-HPL；步骤为：

取冻干苋菜13-HPL微粒体酶粉加入8-12倍酶粉量(v/w)的缓冲液C，洗 涤去除酶粉中所含蔗糖和色素，于0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取 沉淀；沉淀溶于磷酸钠缓冲液D，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min， 取上清；

上清液加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度达10％～50％，于0～4℃，5000～ 50000g离心10～60min，取沉淀；

沉淀用缓冲液D于0～4℃透析过夜，并在5000～50000g离心10～60min， 取上清；上清液过0.22μm微孔滤膜，透过液即为初步纯化苋菜13-HPL；

(3)电泳纯纯化：将初步纯化13-HPL经羟基磷灰石柱，阴离子交换柱， 超滤浓缩，得分子量为55KD电泳纯的苋菜13-HPL；步骤为：

取初步纯化苋菜13-HPL上羟基磷灰石柱，用含0.01～0.4mol/L磷酸根的缓 冲液D阶段洗脱收集活性组分；经超滤管浓缩脱盐后上DEAE-Toyopearl离子交 换柱，后用含0～0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液E阶段洗脱，收集活性组分， 经超滤管浓缩，得电泳纯苋菜13-HPL；

缓冲液A：含0.5％聚乙烯吡咯烷酮的0.1mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液；

缓冲液B：含10mmol/L DTT和10％蔗糖的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl缓 冲液；

缓冲液C：0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液；

缓冲液D：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的pH6.8磷酸钠缓冲液；

缓冲液E：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的0.02mol/L、pH8.5 Tris-HCl缓冲液。

2.根据权利要求1所述电泳纯苋菜13-HPL的制备方法，其特征在于所述 超滤管为Millipore出产的15mL超滤管，截留分子量为100KD；所述羟基磷灰 石柱为40μm I型羟基磷灰石柱，事先用缓冲液D平衡过夜；所述阴离子交换柱 为DEAE-Toyopearl柱，事先用缓冲液E平衡过夜。