[发明专利]一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶的制备方法

说明书

技术领域

一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶的制备方法，具体以苋菜 (Amaranthus mangostanus L.)为原料，通过该方法得到电泳纯的苋菜13-氢过 氧化裂解酶。属于利用盐析、色谱分离技术和膜分离技术纯化膜蛋白技术领域。

背景技术

氢过氧化物裂解酶(HPL)是植物脂氧化途径中脂肪氧合酶(LOX)下游 的酶，可将LOX作用下多不饱和脂肪酸形成的氢过氧化脂肪酸裂解形成含氧酸 和挥发性醛类。根据底物过氧基位置的差异，HPL可分为两类：第一类可裂解 13位氢过氧化物生成6C醛类和12C含氧酸，称为13-HPL；第二类可裂解9位 氢过氧化物生成9C醛类和9C含氧酸，称为9-HPL。由13-LOX和13-HPL共同 催化得到的6C醛类(包括己醛，己烯醛)具有清新芳香风味，在国外被称作“Green Notes”。这些挥发性醛类被广泛应用于香精、香水制造业和食品工业，例如用于 长期存储或杀菌后果蔬新鲜气味的重塑。

HPL广泛存在于绿色高等植物中，Tressl和Drawert首先于1973年报道了 香蕉中HPL的存在，随后研究者们相继在西瓜秧苗、黄瓜秧苗、番茄和茶叶中 发现HPL并进行了性质研究。最近据报道，已从青椒果实、番茄叶、紫花苜蓿、 番石榴和向日葵中得到基本纯的HPL。而国内尚无有关此酶的报道。

HPL是一种膜蛋白，色谱行为差，且在植物组织中含量较低易受季节影响。 此外，酶活性中心部位含有巯基，不稳定，易受外界条件影响氧化聚集失活。 这都是HPL研究较少、进展缓慢的主要原因。建立一种克服季节影响，有效的 氢过氧化物裂解酶分离纯化方法，是开发利用该酶的关键步骤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冻干苋菜13位氢过氧化物裂解微粒体酶和其纯 化工艺。

本发明的技术方案：一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶，简称电泳纯 苋菜13-HPL，的制备方法，步骤为：苋菜13-HPL冻干微粒体酶的制备、初步 纯化、电泳纯纯化；

(1)制备苋菜13-HPL冻干微粒体酶：以苋菜为原料，清洗并除去其中的 泥沙及其它杂物，摘除根部和茎，沥干水分，将苋菜叶切成小片，苋菜叶与在0～ 10℃预冷的0.5～5倍体积/苋菜叶重量(v/w)的缓冲液A混合、且在组织捣碎 机中均浆10s-300s，经四层纱布过滤；

将纱布过滤液在0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀溶于10～ 50倍体积/沉淀重量(v/w)的缓冲液B，分装，冷冻干燥36～108h得冻干苋菜 13-HPL微粒体酶；

(2)初步纯化：冻干苋菜13-HPL微粒体酶经洗涤，溶解，硫酸铵沉淀， 透析，微滤获得初步纯化苋菜13-HPL；步骤为：

取冻干苋菜13-HPL微粒体酶粉加入8-12倍酶粉量(v/w)的缓冲液C，洗 涤去除酶粉中所含蔗糖和色素，于0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取 沉淀；沉淀溶于磷酸钠缓冲液D，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min， 取上清；

上清液加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度达10％～50％，于0～4℃，5000～ 50000g离心10～60min，取沉淀；

沉淀用缓冲液D于0～4℃透析过夜，并在5000～50000g离心10～60min， 取上清；上清液过0.22μm微孔滤膜，透过液即为初步纯化苋菜13-HPL；

(3)电泳纯纯化：将初步纯化13-HPL经羟基磷灰石柱，阴离子交换柱， 超滤浓缩，得分子量约为55KD电泳纯的苋菜13-HPL；步骤为：

取初步纯化苋菜13-HPL上羟基磷灰石柱，用含0.01～0.4mol/L磷酸根的缓 冲液D阶段洗脱收集活性组分；经超滤管浓缩脱盐后上DEAE-Toyopearl离子交 换柱，后用含0～0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液E阶段洗脱，收集活性组分， 经超滤管浓缩，得电泳纯苋菜13-HPL；

缓冲液A：含0.5％聚乙烯吡咯烷酮的0.1mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。

缓冲液B：含10mmol/L DTT和10％蔗糖的0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓 冲液。

缓冲液C：0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。