[发明专利]黄麻根系总蛋白双向电泳方法

权利要求书

1.一种黄麻根系总蛋白双向电泳方法，其特征在于按下列步骤进行：

1)采集黄麻根系，超纯水清洗干净，用液氮罐装运回，在实验室-70℃以下保存备 用；

2)将2g黄麻根系迅速放入冰浴的研钵中加入液氮研磨，研磨过程中加入0.2g聚 乙烯吡咯烷酮，直到研磨成细粉，转入预冷-20℃的50ml离心管；

3)加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-20℃1.5h， 三氯乙酸提取液配制：质量体积比10％三氯乙酸TCA，质量体积比0.07％二硫苏糖 醇DTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，溶剂为丙酮；

4)35000g，4℃离心15min，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合 后，放在-20℃1h，期间间隔涡旋；样品洗涤液配制：质量体积比0.07％DTT，1mM PMSF， 溶剂为丙酮；

5)20000g，4℃离心15min，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合 后，放在-20℃1h，期间间隔涡旋；

6)重复步骤5)一次；

7)20000g，4℃离心15min，去掉上清后，用滤纸封口，真空干燥；

8)将粗蛋白溶于裂解液，室温1.5h；裂解液配制：7M尿素、2M硫脲、质量体 积比4％3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、1mM PMSF、体 积比0.2％载体两性电解质；

9)离心，得到上清液用3倍体积预冷的样品洗涤液-20℃沉淀0.5h后再20000g、 4℃、15min离心，弃上清液；

10)沉淀再次溶解于步骤8)中的500μl裂解液，充分溶解后，离心，取上清；

11)蛋白质定量：采用Bradford法测定其蛋白浓度；

12)第一向等电聚焦电泳：按上样量350μg，上样体积330μl，对已定量好的蛋白 样品进行稀释，上样水化液同步骤8)中的裂解液，将样品加入固相pH梯度IPG胶条 聚焦盘内后，再将pH 4-7，17cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液间的 气泡，用2.5ml矿物油/条，覆盖胶条，进行等电聚焦；

13)胶条平衡：将聚焦好后的固相pH梯度IPG胶条进行平衡I、II，每次平衡时 间为20min，平衡缓冲液配制如下：

胶条平衡缓冲液母液：6M尿素，质量体积比2％十二烷基磺酸钠SDS，0.375M pH8.8的Tris-HCl，体积比20％甘油，溶剂为水。

胶条平衡缓冲液I：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.2g DTT；

胶条平衡缓冲液II：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.25g碘乙酰胺；

14)第二向SDS-PAGE电泳：将平衡好的胶条置于胶浓度为质量体积比12％的 SDS-PAGE胶上，用质量体积比0.5％、含有质量体积比0.002％溴酚蓝的低熔点琼脂糖封 胶液封住顶部，按如下参数进行电泳：16℃恒温下，恒功率，先用1瓦/条，1.5h；再用 15瓦/条，4～6h；

15)染色方法：采用硝酸银法进行染色。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，整个过程的溶液配制均需用超纯水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，裂解液与上样水化液均需现用现配。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，整个过程所需的DTT均需现用现加。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤12)中的等电聚焦参数设置如 下：50V水化，13h；250V慢速，1h；500V慢速，1h；2000V线性，1h；8000V线 性，4h；8000V快速，60000V.h；500V快速，保持。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤14)中胶浓度质量体积比12％ 的SDS-PAGE凝胶所用的溶液体积比含量为，水∶质量体积比30％丙烯酰胺∶0.375M pH8.8 的Tris-HCl∶质量体积比10％十二烷基硫酸钠∶质量体积比10％过硫酸铵∶体积比10％ 四甲基乙二胺＝33∶40∶25∶1∶1∶0.15。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤15)中的染色方法程序如下：

步骤1：取50ml冰乙酸、200ml无水乙醇、加水至500ml固定，1.5h；

步骤2：取1g硫代硫酸钠，56.36g三水合乙酸钠，150ml无水乙醇，加水至500ml 敏化，30min；

步骤3：500ml水漂洗三遍，5min/次；

步骤4：1.25g硝酸银溶于500ml水，避光银染，20min；

步骤5：500ml水漂洗二遍，1min/次；

步骤6：12.5g无水碳酸钠，0.2ml甲醛，加水至500ml，显色共2次；第一次待 溶液变黄后倒掉，第二次显色到理想的背景和清晰度；

步骤7：7.3g Na₂EDTA溶于500ml水终止，10min。