[发明专利]黄麻根系总蛋白双向电泳方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄麻的根系总蛋白双向电泳方法，属于生物技术领域。是能够在沿 海滩涂大面积生长的黄麻根系的蛋白质组分离，该方法可直接应用于能够在沿海滩涂生 存的高耐盐植物研究开发利用。

背景技术

抗逆性是植物在系统进化过程中，为适应不良环境获得的一种对策。在植物的生 存环境中一些非生物因子胁迫，对植物的生长发育和生存都会产生严重的影响，为了应 对外界环境的不利影响，植物在进化过程中形成了完整的防御机制。为了解析其防御机 制就势必需要分离一些与逆境相关的蛋白质。

黄麻(Orchorus olitorius L.)又称络麻、绿麻，是一种能在沿海滩涂地大面积生 长的一年生草本韧皮纤维经济作物，在沿海滩涂开发热的今天可作为滩涂改良的先锋作 物。由于其能够耐受沿海滩涂高盐胁迫，因此成了耐盐性研究中的一种优秀的指示植物 材料。

但由于其植物体内含有盐渍化条件下产生的多种次生代谢物(色素、酚类、醌类 等)，众多干扰使得作为蛋白质组研究的核心技术-双向电泳成为挑战，常规方法不能成 功制备纯度高的蛋白，在电泳过程中，合理的参数设定可有效的除盐，聚焦等。以黄麻 植物根系为材料，进行根系总蛋白的制备，建立适用于黄麻根系蛋白质组学分离的双向 电泳方法，可为盐渍化环境下植物材料耐盐性蛋白质组学研究提供实验基础和参考。

本发明的突破点就是建立盐渍化环境下的高耐盐植物黄麻的双向电泳方法体系， 利用该方法可对黄麻进行蛋白质组学研究分析。

发明内容

技术问题

本发明目的在于提供一种黄麻根系的总蛋白分离的双向电泳方法，是针对能够生存 在沿海滩涂的植物黄麻的根系总蛋白采用双向电泳方法进行分离，该技术经反复实验证 明样品制备全、分离蛋白点多、重复性好、图谱清晰，是一套适用于黄麻根系总蛋白组 分析的双向电泳技术。

技术方案

本发明所述的一种黄麻根系的总蛋白双向电泳方法，按下列步骤进行：

1)采集黄麻根系，超纯水清洗干净，用液氮罐装运回，在实验室-70℃以下保存备 用；

2)将2g黄麻根系迅速放入冰浴的研钵中加入液氮研磨，研磨过程中加入0.2g聚 乙烯吡咯烷酮，直到研磨成细粉，转入预冷-20℃的50ml离心管；

3)加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-20℃1.5h， 三氯乙酸提取液配制：质量体积比10％三氯乙酸TCA，质量体积比0.07％二硫苏糖 醇DTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，溶剂为丙酮；

4)35000g，4℃离心15min，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合 后，放在-20℃1h，期间间隔涡旋；样品洗涤液配制：质量体积比0.07％DTT，1mM PMSF， 溶剂为丙酮；

5)20000g，4℃离心15min，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合 后，放在-20℃1h，期间间隔涡旋；

6)重复步骤5)一次；

7)20000g，4℃离心15min，去掉上清后，用滤纸封口，真空干燥；

8)将粗蛋白溶于裂解液，室温1.5h；裂解液配制：7M尿素、2M硫脲、质量体 积比4％3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、1mM PMSF、体 积比0.2％载体两性电解质；

9)离心，得到上清液用3倍体积预冷的样品洗涤液-20℃沉淀0.5h后再20000g、 4℃、15min离心，弃上清液；

10)沉淀再次溶解于步骤8)中的500μl裂解液，充分溶解后，离心，取上清；

11)蛋白质定量：采用Bradford法测定其蛋白浓度；

12)第一向等电聚焦电泳：按上样量350μg，上样体积330μl，对已定量好的蛋白 样品进行稀释，上样水化液同步骤8)中的裂解液，将样品加入固相pH梯度IPG胶条聚 焦盘内后，再将pH 4-7，17cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液间的气 泡，用2.5ml矿物油/条，覆盖胶条，进行等电聚焦；

13)胶条平衡：将聚焦好后的固相pH梯度IPG胶条进行平衡I、II，每次平衡时 间为20min，平衡缓冲液配制如下：