[发明专利]一种双烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法无效
申请号: | 200910232656.5 | 申请日: | 2009-12-04 |
公开(公告)号: | CN101713783A | 公开(公告)日: | 2010-05-26 |
发明(设计)人: | 宓晓黎;黄丽俊;陆茂林;肖华龙;李利东;杜妹莲 | 申请(专利权)人: | 江苏省微生物研究所有限责任公司 |
主分类号: | G01N33/74 | 分类号: | G01N33/74;G01N33/543;G01N33/533 |
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地址: | 214063*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 双烯 检测 试剂盒 及其 方法 | ||
1.一种检测双烯雌酚的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒,其特征是由多孔包被板(1),缓冲液(2),双烯雌酚标准溶液(3),双烯雌酚的抗体(4),铕标记的羊抗兔抗体(5),洗涤液(6)和增强液(7)所组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中的包被板(1)包被固相抗原,用50mmol/L pH9.6Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将DEN-OVA稀释至10mg/L做为包被液,96或48孔微孔板各孔加100μL,4℃放置过夜,弃去包被液,冲洗三次,加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭,4℃放置过夜,弃去封闭液,真空抽干,板条密封后置-20℃冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其中的双烯雌酚标准溶液(3),从DEN纯品中稀释得到,稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液,共6瓶,DEN浓度分别为:0ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,1000ng/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其中的双烯雌酚的抗体冻干品(4),用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2mL混合2mgDEN-BSA,用匀浆器混合2小时,制得油包水抗原乳化剂,取600μL制备好的油包水抗原乳化剂,在新西兰大白兔和BALB/c小白鼠身上多位点地进行皮下注射,在免疫3~4次后,可进行鉴定,血清和腹水合格后稀释、分装、冻干备用。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其中的铕标记的羊抗兔抗体(5),将购得的羊抗兔抗体,经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0,收集蛋白峰,取已转换的羊抗兔抗体加入Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸,反应过夜,反应液经柱层析,收集蛋白峰,稀释、分装备用。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其中的铕标记的羊抗兔抗体(5),取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1mL~2mL,经PD-10柱转换缓冲条件,洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH8.5-9.0缓冲液,收集蛋白峰,经紫外吸收分析定量,用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L,取500-1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中,28-30℃磁力搅拌反应16小时,反应液经用80mmol/LTris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)层析,收集蛋白峰,稀释、分装备用。
7.一种用权利要求1所述的试剂盒检测双烯雌酚的方法,其特征是取包被有DEN-OVA的微孔包被板,加入DEN标准溶液或处理好的样品处里液到各自的微孔中,再加入DEN抗体,振荡反应,洗涤液洗涤,加铕标记的羊抗兔抗体,进行标记免疫反应,洗涤液洗涤,加增强液振荡后测量荧光强度cps,对照标准曲线计算样品中的DEN含量。
8.根据权利要求8所述的检测双烯雌酚的方法,其操作为:取包被有DEN-OVA的微孔包被板,加入50μL的DEN标准或处理好的样品到各自的微孔中,加50μL以缓冲液(2)作稀释剂,1∶20稀释DEN抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗三次,加以缓冲液(2)1∶20稀释的100μL EU3+-羊抗兔抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,用洗涤液洗六次,加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps,从标准曲线计算样品中的DEN含量。
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