[发明专利]一种双烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种检测双烯雌酚的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由多孔包被板(1)，缓冲液(2)，双烯雌酚标准溶液(3)，双烯雌酚的抗体(4)，铕标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/L pH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将DEN-OVA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的双烯雌酚标准溶液(3)，从DEN纯品中稀释得到，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液，共6瓶，DEN浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的双烯雌酚的抗体冻干品(4)，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2mL混合2mgDEN-BSA，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μL制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔和BALB/c小白鼠身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，可进行鉴定，血清和腹水合格后稀释、分装、冻干备用。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，将购得的羊抗兔抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗兔抗体加入Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1mL～2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃ pH8.5-9.0缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L，取500-1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16小时，反应液经用80mmol/LTris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

7.一种用权利要求1所述的试剂盒检测双烯雌酚的方法，其特征是取包被有DEN-OVA的微孔包被板，加入DEN标准溶液或处理好的样品处里液到各自的微孔中，再加入DEN抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的DEN含量。

8.根据权利要求8所述的检测双烯雌酚的方法，其操作为：取包被有DEN-OVA的微孔包被板，加入50μL的DEN标准或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL以缓冲液(2)作稀释剂，1∶20稀释DEN抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液(2)1∶20稀释的100μL EU³⁺-羊抗兔抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的DEN含量。