[发明专利]一种双烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测双烯雌酚(dienoestrol，DEN)的检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(Time resolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)技术领域，用于食品和饲料中双烯雌酚药物残留量的检测。

背景技术

双烯雌酚是一种与己烯雌酚结构类似的人工合成的具有酚羟基结构的二苯乙烯类雌性激素，有与内源性激素相似的生物效应而被广泛地应用于临床中。近年来，许多国家将其加入到动物饲料中，以提高家禽家畜的饲养效率。动物通过食物获得的雌性激素一部分被排泄到环境中，一部分在动物体内残留，并通过食物链在人体内富集。激素类药物残留会使正常人的生理功能发生紊乱，更严重的是影响儿童正常的生长发育，引发动物和人的癌症和致畸毒性，而且妊娠期间使用还能引起后代生殖系统疾病。

由于其致癌作用，我国和FDA、欧盟、美国、日本、加拿大已禁止己烯雌酚在饲料中的使用。目前国内使用较多的为己烯雌酚，国家规定动物组织中不得检出己烯雌酚，双烯雌酚已证实为己烯雌酚的代谢产物。因此，快速准确检测雌性激素对于估计食品安全的潜在因素是很必须的。

双烯雌酚的检测方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱/质谱法(GC/MS)和酶联免疫检测方法(ELISA)等。通常以ELISA作为在现场抽样快速筛选检验方法，HPLC或GC-MS作为确证性检验方法，目前，我国检测机构所用双烯雌酚ELISA检测试剂盒多为国外进口，其价格昂贵，很难在国内推广应用。国产双烯雌酚ELISA试剂盒普遍存在灵敏度不高、假阳性率高、不稳定等问题。

时间分辨荧光免疫分析检测技术是近来发展迅速的高灵敏检测手段。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体(抗原)上的自由氨基连接，制成Eu³⁺标记抗体(抗原)，它与待测样品中的抗原(抗体)结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的含量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-奈甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双烯雌酚试剂盒及检测方法，用于定性或定量地检测食品和饲料中双烯雌酚的残留量；检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小，并具有简便、快速、准确的特点。

本发明的技术方案：该检测双烯雌酚的试剂盒是由1、多孔包被板，2、缓冲液，3、双烯雌酚标准溶液，4、双烯雌酚的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测DEN。采用TRFIA的技术主要有两个方面：第一，特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，Eu³⁺标记抗体的制备。

测定方法为：测定的基础是标记免疫反应。包被有DEN-载体蛋白的微孔板，加入DEN标准溶液或已处理好的样品处理液到各自的微孔中、再加入DEN抗体，振荡反应，游离的DEN与微孔板上的DEN-载体蛋白竞争DEN抗体，洗涤液洗涤，没有连接的DEN抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu³⁺-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu³⁺-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中DEN的量。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.01ng/mL以上。

附图说明

图1：检测双烯雌酚的试剂盒示意图。1、多孔包被板，2、缓冲液，3、双烯雌酚标准溶液，4、双烯雌酚的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液。

图2：DEN-TRFIA标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：制备试剂盒和检测动物组织样品

免疫抗原的制备：