[发明专利]重组人胞红蛋白复性及其对酒精肝损伤保护的药物用途

权利要求书

1.一种重组人胞红蛋白(hCYGB)表达复性制备方法，其特征是采用以下工艺步骤：

(1)本室构建保存的基因工程菌pET28a/hCYGB/BL21(DE3)，在最佳表达条件(IPTG 0.1mM至0.5mM，37℃诱导表达4小时至8小时)培养后，离心收获细胞。

(2)每克细胞加入10ml裂解液(50mM Tris-Cl，pH8.0，50mM EDTA，1mM PMSF)；细胞经过三步的反复冻融后，再用超声破碎菌体；7000g，30min，4℃离心除去上清，包涵体中加入洗涤液(Tris-Cl，pH8.0，5mM EDTA，2％去氧胆酸)5ml洗涤，再次离心除去上清。

(3)包涵体用2ml(6M盐酸胍，50mM Tris-Cl，pH7.5，50mM DTT)溶液煮沸5分钟。离心(10000g，10分钟，4℃)除去不溶物，得到上清蛋白质溶液。

(4)上述所得蛋白质溶液按总蛋白浓度中含有60％rhCYGB计算，加入1倍至2倍于rhCYGB摩尔浓度的血红素于蛋白质溶液中，轻轻搅拌，室温静置5分钟至20分钟，离心(10000g，10分钟，4℃)除去不溶物。

(5)将离心后的上清液透析(透析液：5mM Tris-Cl，pH8.5)过夜，浓缩至蛋白浓度为2mg/ml。透析复性后的蛋白溶液用Sephacryl-S200柱层析(1.5cmx40cm)进行纯化，层析柱体积约为50ml。上样2ml(2mg/ml)rhCYGB样品后用50mM Tris-Cl，pH8.5缓冲液进行洗脱，流速0.8ml/min，紫外检测并分部收集。

(6)SDS-PAGE检测洗脱液，根据蛋白电泳图谱合并含有纯rhCYGB收集管，所得rhCYGB纯化品使用SDS-PAGE和HPLC方法。

2.根据权利要求1所述的重组人胞红蛋白表达复性制备方法，其特征是在复性过程中加入1倍至2倍摩尔量血红素，轻轻搅拌，室温静置5分钟至20分钟，然后透析12小时。

3.根据权利要求1所述的重组人胞红蛋白表达复性制备方法，其特征在于采用Sephacryl-S200柱层析进行进一步复性和纯化重组胞红蛋白(hCYGB)。

4.重组人胞红蛋白对酒精急性肝损伤保护的医药用途，即利用重组人胞红蛋白进行酒精急性肝损伤的预防及药物治疗用途，给药途径包括静脉注射，肌肉注射，口服，粘膜，皮肤和呼吸道。